潘國洪，譚秦東

（1.漢川市人民醫(yī)院藥劑科，湖北漢川432300；2.中南大學湘雅附一醫(yī)院麻醉科，湖南長沙410008）

丹參酚酸注射液對室間隔缺損模型家兔血清候選蛋白標志物FN及心房肌細胞Cx43蛋白的表達影響研究

潘國洪1，譚秦東2

（1.漢川市人民醫(yī)院藥劑科，湖北漢川432300；2.中南大學湘雅附一醫(yī)院麻醉科，湖南長沙410008）

目的探討丹參酚酸注射液對室間隔缺損模型家兔血清候選蛋白標志物FN以及心房肌細胞Cx43蛋白的表達影響。方法選取家兔34只，其中24只室間隔缺損造模，造模成功19只按隨機數(shù)字表達法分為2組，陰性對照組（A組）9只，給予混合飼料和純凈水飼養(yǎng)；丹參酚酸注射液組（B組）10只，在A組飼養(yǎng)的基礎上，按每天劑量為150mg／kg的丹參酚酸注射液進行灌胃；未造模10只家兔作為正常對照組（C組），給予混合飼料和純凈水飼養(yǎng)，由家兔自行飲食。飼養(yǎng)8周后處死家兔，采用熒光定量PCR、免疫組化及免疫印跡法（Western blot）檢測3組家兔血清中候選蛋白標志物FN和心房肌細胞Cx43蛋白表達水平。結果A組家兔血清中候選蛋白標志物FN mRNA表達水平顯著高于B、C組，心房肌細胞Cx43mRNA表達水平顯著低于B、C組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；B組家兔血清中候選蛋白標志物FN mRNA和心房肌細胞Cx43mRNA的表達水平與C組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；A組家兔血清中候選蛋白標志物FN蛋白表達水平顯著高于B、C組，心房肌細胞Cx43蛋白表達水平顯著低于B、C組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；B組家兔血清中候選蛋白標志物FN和心房肌細胞Cx43的蛋白表達水平與C組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結論丹參酚酸注射液能夠明顯降低室間隔缺損模型家兔血清中候選蛋白標志物FN的表達，升高心房肌細胞Cx43蛋白的表達，改善室間隔缺損家兔心臟功能，對臨床具有指導意義，值得臨床推廣。

丹參酚酸注射液；室間隔缺損；候選蛋白標志物FN；心房肌細胞Cx43

室間隔缺損（ventricular septal defect，VSD）是由于左、右心室之間存在一個直接開口，而引起的一種心室水平的左向右分流的先天性心臟病［1］。本病因大、中、小不同缺損程度而表現(xiàn)出不同的臨床表現(xiàn)，小型室間隔缺損收縮期左向右分流不大，患者臨床表現(xiàn)較輕，甚至無癥狀；中型室間隔缺損左、右室之間分流較大，部分患者可表現(xiàn)為勞力性呼吸困難；大型室間隔缺損，收縮期左右室之間無壓力差，左向右分流大，表現(xiàn)為皮膚青紫，嚴重呼吸困難，此類患者生存期較短［2］。本病多發(fā)于兒童，據(jù)調查統(tǒng)計，從1990年的0.13‰上升至2010年的0.42‰，并有逐年上升趨勢［3］。隨著醫(yī)療技術的發(fā)展，本病人們更加重視疾病防治及預后，現(xiàn)代醫(yī)學多采取手術修復缺損為主要治療方法，但手術后常常并發(fā)心律不齊、心肌收縮力下降等心臟疾。研究發(fā)現(xiàn)［4］，丹參酚酸注射液能夠提高室間隔缺損心臟功能，改善臨床癥狀，為了增強療效，改善癥狀、緩解患者痛苦，改善其預后，筆者做了有關研究。通過觀察室間隔缺損模型家兔血清候選蛋白標志物FN以及心房肌細胞Cx43蛋白的表達，來探究丹參酚酸注射液對室間隔缺損的治療效果，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 6個月齡家兔34只，體質量1.74～2.16 kg，家兔購于中國科學院上海動物中心（合格證號：D20021024），實驗開始前在安靜、室溫、避強光的環(huán)境中飼養(yǎng)1周；丹參酚酸注射液（天津天士力之驕藥業(yè)有限公司，國藥準字Z20110011）；兔抗人FN抗體、兔抗人Cx43抗體和ECL化學發(fā)光液購于Cell Signalling Technology公司，本實驗遵循《實驗動物保護條例》，符合3R原則。

1.2 室間隔缺損家兔模型建立 采用改良式Synhorst法建立室間隔缺損模型家兔。全身麻醉理想后，備皮消毒，于胸骨正中切開皮膚，逐層分離肌肉，鋼鋸沿胸骨正中線鋸開胸骨，撐開胸腔，暴露心臟，剪開心包，用4號可吸收縫合線于右心耳處作一荷包縫合，用無損傷鉗夾住心耳，剪刀剪開心耳，經切口將定制的室間隔穿刺器放入右心房，然后快速穿刺進入右心室，迅速收緊荷包。固定心臟后，穿刺器垂直于室間隔快速刺入左心室，拔出穿刺器的內芯，將外環(huán)置于室間隔上。當于右心室壁捫及顫動后緩慢退出穿刺器，結扎荷包。術后予以抗感染對癥治療。1個月后行心臟彩超檢查，若有自左向右血液分流存在時，證明室間隔缺損模型家兔造模成功。

1.3 分組和用藥 造模24只家兔，其中1只家兔因麻醉死亡，2只因術中出血死亡，2只術后心臟衰竭死亡，19只成功造模的家兔隨機分為2組，陰性對照組（A組）9只，給予以混合飼料和純凈水飼養(yǎng)；丹參酚酸注射液（B組）10只，在A組飼養(yǎng)的基礎上，按每天劑量為150mg／kg的丹參酚酸注射液進行灌胃；正常對照組（C組）10只，未造模的家兔，給予以混合飼料和純凈水飼養(yǎng)，由家兔自行飲食。3組家兔均在適宜的相同環(huán)境下飼養(yǎng)8周。

1.4 血清及心房肌樣本采集 3組家兔飼養(yǎng)8周后，于清晨空腹抽取家兔耳緣靜脈血3mL，加入含EDTA-K2抗凝劑的真空管中混勻，放入4℃冰箱內2 h，4000 r／min離心5min，吸取50 μL血清置于0.5mL離心管中，－80℃環(huán)境下保存。抽取耳緣靜脈血后處死家兔，迅速取出心臟，浸泡于10%中性福爾馬林溶液中，固定24 h。經常規(guī)脫水、包埋、切片、HE染色，光鏡下觀察，每張切片選取3個視野，測量的數(shù)值用于統(tǒng)計分析。

1.5 血清候選蛋白標志物FN以及心房肌細胞Cx43蛋白的表達

1.5.1 免疫組化法：采集的標本按常規(guī)脫蠟，采用3%過氧化氫阻斷內源性過氧化物酶，PBS緩沖液沖洗1次，枸櫞酸鹽緩沖液熱修復后，PBS沖洗1次。按照試劑盒說明進行非生物素二步法檢測，DAB-H2O2顯色，Mayer蘇木素復染，采用Image-Pro Plus 6.0軟件分別檢測每個視野ASMC的截面積、累計光密度值，再將累計光密度值／截面積得出平均光密度值，每張切片選取5個視野，取平均值用于統(tǒng)計分析。

1.5.2 Western blot法：分別選取家兔血清樣本和心房肌組織樣本，充分勻漿，加裂解液200μL，13000 r／min，4℃，離心15min，取上清，按BCA蛋白定量試劑盒說明書進行蛋白定量，每孔取20μg總蛋白加入上樣緩沖液，煮沸5 min變性后，10% SDS-PAGE電泳，90 V恒壓下電泳至溴酚藍接近分離膠頂端，然后120 V恒壓電泳至溴酚藍剛出膠底部。100mA恒流電轉2 h。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，繼而加入兔抗人FN抗體、兔抗人Cx43抗體（按1∶1000稀釋）或抗β-actin（1∶2000稀釋），置于4℃環(huán)境中過夜。PBST洗滌3次，每次10min，加入二抗，溫室孵育2 h。再次用PBST洗滌3次，每次10min。將PVDF膜ECL顯色，在暗室中將PBVF曝光于X光片中，用凝膠成像系統(tǒng)掃描分析結果。

1.5.3 熒光定量PCR法：用超純RNA提取試劑盒提取組織樣本中總RNA。實驗操作按產品說明書進行，用紫外分光光度法測定RNA的含量。按逆轉錄試劑盒操作說明合成cDNA，將RNA模板、引物、5×RT Buffer和RNase-free Water溶解并置于冰上備用。將2μL Primermix試劑和10μL消化后RNA分別加入20μL反應體系的第一部分，混勻。95℃孵育5min，迅速冰浴2min，短暫離心，使管壁上的溶液收集到管底。繼續(xù)向以上反應管中加入4μL 5×RT Buffer、2μL 0.1M DTT、1μL 10 mM dNTPEach和1μLHiFi-MMLV Enzyme Mix試劑，輕輕吸打混勻，37℃孵育50min，70°保溫10min。利用FN和Cx43及β-action基因特異引物和SYBR Green熒光染料在PCR儀上進行實時熒光定量擴增。引物序列見表1。PCR產物經聚丙烯酰胺凝膠電泳后，溴化乙啶染色，通過成像分析scion軟件計算和比較FN和Cx43產物條帶的吸光度值，并與β-action條帶光密度值比較，計算出FN和Cx43 mRNA表達含量（見表1）。

表1 目的基因的RT-PCR引物序列Tab.1 Primer sequence of target gene by RT-PCR

1.6 統(tǒng)計學方法 采用統(tǒng)計學軟件SPSS 17.0進行統(tǒng)計學分析，正態(tài)計量資料用“±s”表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 3組家兔FN及Cx43mRNA的相對含量比較 陰性對照組家兔血清候選蛋白標志物FN和心房肌細胞Cx43mRNA相對含量顯著高于B組和C組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；B組家兔經丹參酚酸注射液喂養(yǎng)后，血清候選蛋白標志物FN和心房肌細胞Cx43mRNA相對含量有所改善，但與C組比較存在一定差異，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見表2）。

表2 3組家兔FN及Cx43mRNA的相對含量比較情況Tab.2 Comparison of the relative content of FN and Cx43 mRNA

2.2 3組家兔FN及Cx43蛋白平均光密度值及免疫組化結果 與C組比較，A、B 2組血清候選蛋白標志物FN蛋白表達水平顯著增高（P＜0.05），心房肌細胞Cx43的蛋白表達顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與A組比較，B組血清候選蛋白標志物FN的蛋白表達顯著降低，心房肌細胞Cx43的蛋白表達顯著增高（P＜0.05，見表3，圖1）。

表3 3組家兔FN及Cx43蛋白平均光密度值比較Tab.3 Comparison of FN and Cx43 protein in the average optical density value

圖1 家兔FN及Cx43蛋白表達（DAB，×400）Fig.1 Expression of FN and Cx43 protein（DAB，×400）

2.3 3組家兔FN及Cx43蛋白的相對含量比較 A組家兔血清候選蛋白標志物FN和心房肌細胞Cx43蛋白表達顯著高于B組和C組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；經丹參酚酸注射液喂養(yǎng)B組家兔血清候選蛋白標志物FN和心房肌細胞Cx43蛋白表達與A相比明顯改善，但與C組比較存在一定差異，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見表4，圖2）。

表4 3組家兔FN及Cx43蛋白的相對含量比較情況Tab.4 Comparison of the relative content of FN and Cx43 protein

圖2 家兔血清候選蛋白標志物FN和心房肌細胞Cx43的蛋白電泳圖1，2：正常對照組（C組）；3，4：陰性對照組（A組）；5，6：丹參酚酸注射液（B組）Fig.2 Serum protein electrophoresismap of candidate protein markers of FN and Cx43 in the atrialmuscle cells1，2：normal control group（group C）；3，4：negative control group（group A）；5，6：salvianolate injection（group B）

3 討論

室間隔缺損是常見的先天性心臟病，僅次于房間隔缺損占第二位，是新生兒非感染性死亡的重要因素，在先天性缺陷中具有重要地位［5］。目前臨床中主要以手術修補缺損為主要治療方法，但術后易導致其他心臟疾病，給患者生活治療及患者家庭經濟帶來嚴重影響［6］。探究室間隔缺損的發(fā)病因素，致病機理對提高室間隔缺損的預防和診療措施，改善我國國民身體素質，提高國民生活質量有著重要意義?，F(xiàn)代醫(yī)學對于室間隔缺損的病因和發(fā)病機制尚不明確。隨著蛋白組學技術的發(fā)展，從蛋白質組學的角度來研究室間隔缺損的發(fā)生發(fā)展，為揭示室間隔缺損的病因病機提供一條新的思路［7］。

血清候選蛋白標志物FN是有血管、肝臟和血管平滑肌產生的細胞外基質中的細胞黏附分子，對組織細胞形態(tài)的支持、連接和維持起著重要作用，并對細胞的黏附、增殖、分化具有調控作用，還能促進離子信號交換和損傷修復［8］。FN是心臟發(fā)育必需的調控因子，心臟發(fā)育過程中，心肌細胞的發(fā)育、分化、遷移都離不開FN的調控作用；當心臟神經嵴細胞遷移受阻，影響心臟神經嵴的發(fā)育，從而導致室間隔缺損的發(fā)生［7］。研究發(fā)現(xiàn)［9］，在胚胎發(fā)育、纖維化以及創(chuàng)傷愈合的過程中，血清候選蛋白標志物FN呈現(xiàn)出高度表達，本研究結果顯示，與正常家兔相比，室間隔缺損模型家兔血清候選蛋白標志物FN表達明顯增高，說明室間隔缺損刺激機體對缺損的修復，從而導致調控因子FN的高度表達。心房肌細胞Cx43蛋白是心臟連接蛋白，若Cx43基因產生異常，常引起先天的心臟病的發(fā)生［10］。Cx43組成的連接通道能夠傳遞離子和小分子代謝產物，并且是心肌電耦的基礎物質，對于心肌的連接具有重要作用，若連接通道受損，連接蛋白發(fā)生改變，則導致心血管疾病的發(fā)生［11-12］。本研究結果示，正常家兔心房肌細胞Cx43蛋白表達明顯高于室間隔缺損模型家兔，說明室間隔缺損模型家兔連接通道遭到破壞，心電傳播功能受損，無法直接傳遞離子和小分子代謝產物，嚴重影響心臟的收縮功能。丹參酚酸注射液主要成分為丹參酚，丹參酚能夠改善冠狀動脈血流量，促進心肌細胞再生，缺損的修復，能夠有效地促進室間隔缺損的修復［13］。本研究結果示，經過丹參酚酸注射液處理的室間隔模型家兔血清候選蛋白標志物FN和心房肌細胞Cx43蛋白均明顯改善，說明丹參酚酸注射液能夠促進心房肌細胞Cx43蛋白表達，改善連接通道，恢復離子和小分子代謝的傳遞功能，促進室間隔缺損的修復，下調血清候選蛋白標志物FN的表達，改善心臟收縮功能［14］。

綜上所述，丹參酚酸注射液能夠促進心房肌細胞Cx43蛋白表達，改善Cx43間隙連接通道功能，促進室間隔缺損的修復，從而下調血清候選蛋白標志物FN的表達，改善心肌的收縮功能。提高臨床治療效果，改善患者預后，對臨床具有重要的指導意義。

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（編校：王儼儼，譚玲）

Effect of salvianolate injection on expressions of serum candidate protein markers FN and Cx43 protein in atrialmyocytes of ventricular septal defectmodel rabbit

PAN Guo-hong1，Tan Qin-dong2

（1.Department of Pharmacy，Hanchuan People Hospital，Hanchuan 432300，China；2.Department of Anesthesiology，Xiangya Hospital，Central South University，Changsha 410008，China）

ObjectiveTo investigate the effect of salvianolate injection on expressions of serum candidate protein markers FN and Cx43 protein in atrialmyocytes of ventricular septal defectmodel rabbit.Methods34 rabbits were selected as objects，of which 19 rabbits were modeled successfully after ventricular septal defectmodel constructed in 24 rabbits.19 rabbitswere randomly divided into two groups according to random number table：the negative control group（group A，n＝9）treated withmixed feed and purified water；salvianolate injection group（group B，n＝10）treated with 150mg／（kg·d）salvianolate injection by oral gavage on the basis of group A.10 rabbitswithoutmodeling treated with naturalmixed feed and purified water and were as a normal control group（group C）.Rabbitswere sacrificed after8 weeks.Levels of serum candidate proteinmarkers FN and Cx43 protein in atrial myocytes of three groups were detected by fluorescence quantitative PCR，immunohistochemistry and immunoblotting（Western blot）.ResultsSerum candidate protein markers FNmRNA levels of group A were higher than that in group B and C，levels of Cx43 proteinmRNA in atrialmyocytes of group A were lower than that in group B and C，and the differenceswere statistically significant（P＜0.01）；the difference of serum candidate proteinmarkers FN mRNA levels and levels of Cx43 proteinmRNA in atrialmyocytes between group B and group Cwere significant（P＜0.05）；Serum candidate protein markers FN protein levels of group A were higher than that in group B and C，levels of Cx43 protein in atrialmyocytes of group A were lower than that in group B and C，and the differenceswere statistically significant（P＜0.01）；the difference of serum candidate proteinmarkers FN protein levels and levels of Cx43 protein in atrialmyocytes between group B and group Cwere significant（P＜0.05）.ConclusionSalvianolate injection can significantly reduce the expression of serum candidate protein markers FN，increase expression of Cx43 protein in atrialmyocytes，and improve cardiac function in ventricular septal defectmodel rabbit，which has clinical significance.

book=24,ebook=29

salvianolate injection；ventricular septal defect；candidate protein markers FN；Cx43 protein in atrialmyocytes

R363

A

1005－1678（2014）09－0023－04

潘國洪，男，本科，副主任藥師，研究方向：臨床藥學，E-mail：pangh011＠163.com。