徐廣宇，王春梅，張四喜，王喜斌，陳冬雪，韓東Δ

（1.北華大學(xué)藥學(xué)院，吉林吉林132013；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院藥學(xué)部，吉林長春130021）

北五味子不同活性部位對大鼠酒精性肝損害的影響及對品質(zhì)鑒別的意義

徐廣宇1，王春梅1，張四喜2，王喜斌1，陳冬雪1，韓東1Δ

（1.北華大學(xué)藥學(xué)院，吉林吉林132013；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院藥學(xué)部，吉林長春130021）

目的探索北五味子不同活性部位對酒精引起的大鼠肝損傷的影響。方法取Wistar大鼠125只，隨機分為對照組、損傷組、五味子木質(zhì)素組、多糖組、揮發(fā)油組，用酒精復(fù)制急性酒精中毒肝損傷模型。提取北五味子中的主要成分，之后用北五味子活性成分木質(zhì)素、多糖、揮發(fā)油給各組大鼠灌胃。檢測各組血清中ALT、AST活性，肝勻漿MDA、SOD、ATPase、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶（γ-GT）活性及含量，光鏡下觀察肝臟結(jié)構(gòu)變化。最后檢測各提取物對腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的影響。結(jié)果木質(zhì)素組、多糖組大鼠血清中ALT、AST活性及肝勻漿中MDA較模型組顯著降低（P＜0.05），揮發(fā)油組無明顯變化。木質(zhì)素組、多糖組肝臟勻漿中SOD、ATPase、γ-GT酶活性較模型組顯著增強（P＜0.05）。揮發(fā)油可增強SOD、ATPase活性但不能增強γ-GT酶活性。光鏡下觀察木質(zhì)素組、多糖組大鼠組織脂肪變、線粒體腫脹的有所緩解。木質(zhì)素、多糖可抑制TNF-α的釋放。結(jié)論北五味子活性成分木質(zhì)素、多糖對酒精引起的肝臟損傷有保護作用，可作為相應(yīng)的評價指標(biāo)。

北五味子；木質(zhì)素；多糖；揮發(fā)油；肝損傷

北五味子Schisandra chinenesis（Turcz.）Baill.為木蘭科植物中華五味子的干燥成熟果實，主產(chǎn)于吉林、遼寧、黑龍江等省。能益氣生津，補腎養(yǎng)心，收斂固澀［1］。目前發(fā)現(xiàn)五味子中含有木質(zhì)素、多糖、揮發(fā)油及有機酸等活性成分，各種成分在藥用價值方面既有相同的作用，同時也各自特點［2-4］。但目前尚無對北五味子各成分作用比較的研究，本實驗旨在對北五味子各成分對酒精引起的肝臟損傷影響的比較，來進一步對北五味子質(zhì)量評價提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：Wistar大鼠，清潔級，125只，體質(zhì)量（200±20）g，由吉林大學(xué)白求恩動物實驗中心提供。

1.1.2 主要藥品及試劑：50°紅星二鍋頭，北五味子（購買于吉林市善德堂大藥房）；ALT、AST、SOD、MAD、ATPase、γ-GT檢測試劑盒、HE染色試劑盒（南京建成生物工程研究所）；Trizol、Rnasin（購于大連寶生物工程有限公司）；PCR引物（購于上海生工合成）。

1.1.3 實驗儀器：ST16R型臺式低溫離心機（Thermo公司）；MDF-UT386S型－80℃超低溫冰箱（SANYO）；DM2500型光學(xué)電子顯微鏡（Leica公司）。

1.2 方法

1.2.1 北五味子各活性成分的提?。?］：取北五味子粉碎過120目篩，烘干后稱2份，每份10 g，按沈文［6］的改良的水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油。離心上述溶液后取上清，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至20mL，加入80mL無水乙醇，靜置過夜后再次離心，沉淀用無水乙醇洗滌3次，冷凍干燥，使用蒸餾水溶解，即為多糖提取液，取少量進行含量測量。離心液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮蒸干，使用甲醇溶解，即為木質(zhì)素溶解液，利用高效液相色譜檢測木質(zhì)素的含量。

1.2.2 實驗分組及模型制備：取Wistar大鼠125只，隨機分為對照組、損傷組、五味子木質(zhì)素組、多糖組、揮發(fā)油組。對照組的大鼠用生理鹽水5mL／kg灌胃，每天1次，連續(xù)10 d；酒精損傷組采用50℃的白酒7ml／kg灌胃，連續(xù)4天，之后的1周用同量的生理鹽水灌胃；木質(zhì)素處理組前4 d同酒精損傷組，之后的1周給予1.2.1中提取的木質(zhì)素灌胃濃度為100mg／kg；多糖處理組前4 d同酒精損傷組，之后的1周給予1.2.1中提取的多糖灌胃濃度為100mg／kg；揮發(fā)油處理組前4 d同酒精損傷組，之后的一周給予1.2.1中提取的揮發(fā)油灌胃濃度為100mg／kg。

1.2.3 指標(biāo)檢測

①ALT、AST活性的測定：處死小鼠、分離血清，按試劑盒的步驟進行測定小鼠血清ALT、AST活性。

②血清中SOD、MAD測定：取出大鼠肝臟生理鹽水漂洗3次，將左葉的一半剪碎，放入勻漿器中，加入預(yù)冷的滅菌生理鹽水做勻漿介質(zhì)，2500 r／min，離心2min，取上清，制成10%的肝勻漿于4℃保存。另一半制作HE染色切片。將部分10%的肝臟均漿，4000 r／min，離心10min，取上清按試劑盒說明書測定SOD活性及MDA含量。

③肝線粒體與微粒體的制備及酶活性測定：取部分10%肝臟均漿，4℃、10000 r／min，離心15 min，收集沉淀為線粒體，測其按試劑盒說明書測定ATPase；將上清液再次40000 r／min離心30min，沉淀為微粒體，按說明書測定微粒體中γ-GT活性的測定。

④肝臟組織HE染色標(biāo)本處理：將②中的另一半肝臟組織，經(jīng)固定、梯度脫水、浸透、包埋、切片、染色、脫水透明等處理后在光學(xué)顯微鏡下用10倍鏡觀察并拍照。

⑤肝臟組織中TNF-α表達水平的檢測：按照Trizol說明書的操作步驟提取肝臟中的RNA，將RNA溶解在10μLDEPC處理過的水中。然后將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的方法如下：9μL的RNA溶液加入1μL的oligo dT（10 umol），65℃10min，然后迅速冰上孵育2min，接著依次加入下列物質(zhì)：5μL 5×AMV buffer、8μL dNTP（2.5mM）、0.5μL Rnasin、1μL AMV（20 U／μL）。混勻后，置42℃（AMV工作溫度）水域1 h。將上述反應(yīng)移至68℃水浴10 min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，保存?zhèn)溆?。通過PCR將DNA片段擴增，反應(yīng)體系為25μL體系，里面含有：2μL模板、0.5μL上游引物（10μmol／L）、0.5下游引物（10μmol）、2.5μL 10×EasyTaq Buffer、2μL dNTP（2.5 mM），0.25μL EasyTaq DNA Polymerase（5 U／μL）、17.75μL超純水。內(nèi)參基因β-action的引物序列為：5'-CCTTCCTTCTTGGGTATG-3'和5'-AGGGACTTCCTGTAACC-3'.目的基因TNF-α的引物序列為：5'-GACCCTCACACTCAGATCATCT-3'和5'-TCCCTTCACAGAGCAATGACTC-3'。PCR的反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性2min，94℃變性30 s，55℃退火30 s秒，72℃延伸1min，反應(yīng)的最后是72℃延伸5min，總共30個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物跑1.5%瓊脂糖凝膠電泳（120 V，202min），凝膠成像系統(tǒng)分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 北五味子活性成分對酒精性肝損傷后ALT、AST活性的測定結(jié)果 與對照組相比，模型組ALT、AST活性顯著升高（P＜0.05），表明模型制作成功。與模型組相比，木質(zhì)素、多糖組ALT、AST活性均顯著降低（P＜0.05），說明木質(zhì)素與多糖均具有逆轉(zhuǎn)酒精所致肝臟損傷的作用。但木質(zhì)素與多糖相比，并無明顯差異。揮發(fā)油對酒精導(dǎo)致的肝臟損傷無明顯的作用。

圖1 酒精性肝損傷后北五味子活性成分對血清ALT和AST影響Fig.1 Effect of active ingredients of fructus schisandrae chinensis on serum ALT and AST after alcoholic liver injury*P＜0.05，與對照組相比；＃P＜0.05，與模型組相比*P＜0.05，compared with control group；＃P＜0.05，compared with model group

2.2 北五味子活性成分對肝勻漿酶活性及酶含量的影響

與對照組相比，模型組肝臟勻漿中的MDA顯著升高，酶活性顯著降低（P＜0.05），說明模型制作成功。經(jīng)木質(zhì)素、多糖干預(yù)后肝臟勻漿中的MDA明顯減少（P＜0.05），SOD、ATPase、γ-GT的活性明顯增加（P＜0.05），但木質(zhì)素組和多糖組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。揮發(fā)油干預(yù)的情況下能明顯增加SOD及ATPase的活性（P＜0.05）。但揮發(fā)油不能增加γ-GT的活性，對MDA的影響也不明顯。

表1 北五味子活性成分對酒精性肝損傷后肝勻漿酶活性及酶含量的影響（n＝25）Tab.1 Effect of the active ingredients of fructus schisandrae chinensis on liver homogenate enzyme activity and content after alcoholic liver injury（n＝25）

2.3 光鏡下北五味子活性成分對酒精導(dǎo)致肝臟損傷的影響 光鏡下可見：對照組大鼠的肝臟切片肝小葉結(jié)構(gòu)清晰完整，肝板條索以中央靜脈為中心向四周呈放射狀排列，細胞分界清晰，板件為不規(guī)則肝竇。模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，模糊不清，肝細胞索排列紊亂，肝細胞呈濁腫樣改變，細胞及細胞核腫大淡然，見大小不能空泡，肝細胞內(nèi)脂肪空泡形成，脂肪變性范圍不等，部分可見壞死。木質(zhì)素組、多糖組干預(yù)的大鼠肝臟切片，肝小葉結(jié)構(gòu)基本正常，肝細胞排列尚整齊，中央靜脈周圍可見部分肝細胞變性，肝細胞腫脹程度較模型組減輕，且、灶狀壞死面積減少，脂變減輕，大泡性脂變減少。揮發(fā)油組肝小葉界限不清，肝細胞索排列紊亂，肝細胞呈球形腫大改變，細胞及細胞核腫大淡然，見大小不等空泡，脂肪空泡形成分布于小葉各帶（見圖2）。

圖2 各組肝臟組織的光鏡圖（×100）Fig.2 Liver tissues of each group undermicroscope（×100）

2.4 五味子活性成分小鼠對肝臟中TNF-α表達的影響如圖3所示，檢測了肝臟勻漿中編碼TNF-α的mRNA的量來反映肝臟組織中TNF-α的表達情況，由圖可見對照照組未見TNF-α，與模型組存在顯著差異，模型制造成功。揮發(fā)油組與模型組未見明顯差異，故揮發(fā)油對抑制TNF-α無作用，木質(zhì)素及多糖組，與模型組相比TNF-α的表達明顯下降，與模型組存在顯著差異。

圖3 北五味子活性成分對肝臟中TNF-α表達的影響1.對照組；2.模型組；3.木質(zhì)素組；4.多糖組；5.揮發(fā)油組＃P＜0.05，與對照組相比；*P＜0.05，與模型組相比Fig.3 Effect of the active ingredients of fructus schisandrae chinensis on TNF alpha expressed in the liver1.control group；2.model group；3.lignin group；4.polysaccharide group；5.volatile oil group＃P＜0.05，compared with control group；*P＜0.05，compared with model group

3 討論

五味子為我國的傳統(tǒng)中藥，因其具有保肝、抗氧化、增強免疫力、抑菌、抗腫瘤等多種活性而被廣泛使用。對五味子的研究也日益受到大家的重視。目前在五味子中已分離出200多種成分［7-8］，藥理作用的研究主要集中于木質(zhì)素、多糖及揮發(fā)油3個有效部位，涉及有機酸的研究較少。

五味子按產(chǎn)地分為北五味子和南五味子，南、北五味子外型及功效接近，但不同產(chǎn)地五味子有效成分含量又有微妙的變化。可以通過各成分含量的變化對五味子的質(zhì)量進行評估。尤其是五味子中不同成分所具有的生物學(xué)活性不同。本實驗中發(fā)現(xiàn)五味子多糖可顯著降低酒精損傷大鼠肝臟的谷丙轉(zhuǎn)氨酶及谷草轉(zhuǎn)氨酶，增加抗氧化酶的活性，并抑制炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生。同時五味子多糖能升高肝臟均漿中SOD水平并且使MDA水平明顯下降，故其抗氧化及抗衰老的作用也明確。還有研究發(fā)現(xiàn)五味子多糖具有增強免疫及抗腫瘤的作用。上述實驗還發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素同樣有上述活性，但2者間的作用并沒有較大的差別。一般木質(zhì)素的含量占五味子的2%～8%，而多糖的含量最高點達14.7%［9-10］。故含木質(zhì)素及多糖含量多的五味子品質(zhì)越優(yōu)良。甚至有一些文章進一步將木質(zhì)素及多糖成分細化，找出其發(fā)揮作用的有效成分［11］。五味子中的揮發(fā)油主要成分為萜類化合物，早期的研究認為揮發(fā)油主要與五味子的毒性及其鎮(zhèn)靜作用有關(guān)，但目前尚無研究發(fā)現(xiàn)揮發(fā)油具有抗氧化及抑制腫瘤細胞生長的作用，本實驗也得到了證實。在本實驗當(dāng)中揮發(fā)油對酒精性肝臟損害并未表現(xiàn)出保護作用，但揮發(fā)油可以增加SOD、ATPase酶的活性，進一步證實揮發(fā)油具有抗氧化等的作用。但揮發(fā)油是否還有其他作用，仍需進一步探索。

北五味子傳統(tǒng)經(jīng)驗鑒別對一等、二等商品均有如下要求：果肉味酸，種子有香氣、味辛微苦［11］；2010藥典關(guān)于北五味子含量測定的規(guī)定僅為五味子醇甲不得少于0.4%。從中看出，傳統(tǒng)經(jīng)驗鑒別的考察范圍至少還包括有機酸、揮發(fā)油。相對于北五味子眾多的功效而言，藥典中定量檢測的項目顯然單一。隨著研究的深入，木質(zhì)素、多糖、揮發(fā)油、有機酸4個活性部位中代表物質(zhì)的含量及相互比例，可能反映出不同五味子商品品質(zhì)、功效上的差異性。這種差異取決于品種、產(chǎn)區(qū)、產(chǎn)地加工等多種因素。建立科學(xué)、系統(tǒng)的定量檢測體系以綜合全面反映、控制藥材的質(zhì)量，需要結(jié)合傳統(tǒng)中醫(yī)藥經(jīng)驗中的線索，考慮如何運用現(xiàn)代藥理研究技術(shù)。定量檢測體系對于功效較多、產(chǎn)區(qū)廣泛、加工炮制繁復(fù)的大宗藥材質(zhì)量鑒別有著重要意義。

綜上所述，北五味子木質(zhì)素、多糖對酒精引起的肝臟損傷有保護作用，揮發(fā)油對酒精性肝臟損害并未表現(xiàn)出保護作用。北五味子木質(zhì)素、多糖含量與其品質(zhì)相關(guān)，可作為相應(yīng)的評價指標(biāo)，其含量及比例對保肝的作用可作進一步研究。

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（編校：吳茜）

Effect of active ingredients of fructus schisandrae chinensis on rats w ith Alcoholic liver damage

XU Guang-yu1，WANG Chun-mei1，ZHANG Si-xi2，WANG Xi-bin1，CHEN Dong-xue1，HAN Dong1Δ

（1.Pharmaceutical College，Beihua University，Jilin 132011，China；2.Department of Pharmacy，The First Affiliated Hospital of Jilin University，Changchun 130021，China）

ObjectiveTo investigate the effect of active ingredients of fructus schisandrae chinensis on ratswith alcoholic liver damage.Methods125 Wistar ratswere random ly divided into control group，injury group，lignans group，polysaccharide group and volatile oil group，and acute alcoholic liver injury models were constructed.The main ingredient of fructus schisandrae chinensis were extracted and lavage the rats with lignin，polysaccharides，volatile oil of fructus schisandrae chinensis，the activity of serum ALT and AST，liver homogenate MDA，SOD and ATPase，gamma glutamine transferase（gamma GT）activity and its content in each groupswere detected，the change of liver structurewere observed and various extracts on the tumor necrosis factor alpha（TNF alpha）were detected.ResultsRats serum ALT，AST activitives and MDA contents in lignin group and polysaccharide group were significantly lower than model group（P＜0.05）.There was no significant alteration of the volatile oil.The enzyme activity of SOD，ATPase，γ-GT in liver homogenate of lignin group and polysaccharide group were significantly enhanced（P＜0.05）.Volatile oil increased SOD and ATPase activity but not enhancedγ-GT enzyme activity.Then observe the lignin fatty change caused by alcohol，polysaccharide group organization，mitochondrial swelling eased.Lignin，polysaccharide can inhibit the release of TNF-α.ConclusionLignin，polysaccharide，the active ingredients of fructus schisandrae chinensis，protects liver damage caused by alcohol.

fructus schisandrae chinensis；lignin；polysaccharides；volatile oil；liver damage

R944.9

A

1005－1678（2014）09－0054－04

吉林省教育廳“十二五”科學(xué)技術(shù)研究項目（吉字［2012］第165號，吉字［2014］第505號）

徐廣宇，男，博士，講師，研究方向：微生物與生化藥學(xué)領(lǐng)域，E-mail：xuguangyu2005＠163.com；通信作者：韓東，男，碩士，講師，研究方向：領(lǐng)域中藥材品質(zhì)評價，E-mail：ishandong＠tom.com。