程俊文，賀亮*，李肖娟，胡傳久，魏海龍，付立忠，李海波

(1.浙江省林業(yè)科學研究院，浙江省森林資源生物與化學利用重點實驗室，杭州310023；2.杭州雪域生物技術(shù)有限公司)

靈芝(Ganodermalucidum)是一種藥用價值很高的名貴真菌，現(xiàn)代醫(yī)學研究已證實：靈芝對多種疾病尤其是癌癥、心臟病、腦血栓等嚴重威脅人類生命的疾病具有十分顯著的療效[1]。近年來，隨著人們生活水平和保健意識的提高以及相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)的拓展，僅靠野外采集或人工栽培子實體已不能滿足人們對靈芝的需求，因而利用液體深層發(fā)酵技術(shù)大量而且快速地生產(chǎn)靈芝發(fā)酵產(chǎn)物的方法得到了普遍應(yīng)用[2]。

響應(yīng)曲面法(response surface methodogy，RSM)是建立一個包括各因素的一次項、平方項和任何兩個因素之間的一級交互作用項的數(shù)學模型。近年來日益受到重視, 該方法采用可以建立連續(xù)變量曲面模型，對影響生物產(chǎn)量的因子水平及其交互作用進行優(yōu)化與評價，從而快速有效地確定生物過程的最佳條件。目前該方法現(xiàn)已廣泛用于發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化、培養(yǎng)條件優(yōu)化和酶解等生化反應(yīng)優(yōu)化和模型建立中[3-4]。本實驗以靈芝胞外多糖為目標產(chǎn)物，利用Box-Behnken設(shè)計和響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基組成來提高靈芝液體發(fā)酵胞外多糖的產(chǎn)量，為以后的發(fā)酵和放大實驗奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 供試菌株

靈芝(Ganodermalucidum)：由浙江省林業(yè)科學研究院生物技術(shù)研究所實驗室保藏。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 斜面PDA活化菌種用。

1.2.2 液體種子培養(yǎng)基。馬鈴薯100g/L，葡萄糖15g/L，酵母粉5 g/L，KH2PO41g/L，MgSO40.5g/ L。

1.2.3 搖瓶發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基。葡萄糖20g/L，酵母粉5 g/L，KH2PO41g/L，MgSO40.5g/L。

1.3 培養(yǎng)方法

1.3.1 斜面培養(yǎng)。從母種試管中切出蠶豆大小的菌絲塊接種于斜面的中部，在25℃培養(yǎng)7d。

1.3.2 液體種子培養(yǎng)將活化的斜面菌種切割成黃豆大小的菌絲塊，接種于液體培養(yǎng)基中，500mL 三角瓶裝培養(yǎng)基150mL于25℃，150r/min培養(yǎng)7d。

1.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)。采用二級搖瓶，500mL三角瓶裝液量150mL，液體菌種接種量為10%，于25℃，150r/min培養(yǎng)。

1.4 實驗設(shè)計

1.4.1 單因素實驗

以葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、玉米粉、小麥粉取代搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖，分別進行碳源種類試驗；以酵母粉、蛋白胨、豆餅粉、麥麩、牛肉浸膏取代酵母粉，分別進行氮源種類試驗；以10～30g/L葡萄糖進行碳源濃度梯度試驗，以2～16g/L的酵母粉進行氮源濃度梯度試驗。

1.4.2 響應(yīng)面法分析實驗

綜合單因素試驗結(jié)果，選擇葡萄糖、玉米粉、豆餅粉3個因素所確定的水平范圍，運用Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計原理[5]，采用3因素3水平的響應(yīng)面設(shè)計，利用DesignExpert8.05軟件對實驗數(shù)據(jù)進行回歸分析。自變量的試驗水平分別以-1、0、1進行編碼，試驗因素及水平設(shè)計見表1。

表1 響應(yīng)面分析因子及水平表

1.5 分析方法

1.5.1 菌絲干重測定

取100mL發(fā)酵液，在3000r/min離心20min，經(jīng)自來水洗滌多次后，將菌絲體在105℃烘干至恒重，電子天平稱重。

1.5.2 胞外多糖(extracellular polysaccharides，簡寫EPS)的測定

收集發(fā)酵液，3000r/ min離心20min，取上清液，濃縮，加入3倍體積的95%酒精，4℃冰箱醇沉24h，4000r/min離心20min得沉淀物，用硫酸-苯酚法測定其多糖的含量[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果與分析

表2 不同碳源對靈芝液體發(fā)酵胞外多糖的影響

表3 起始碳源濃度對菌絲體生物量和胞外多糖產(chǎn)量的影響

表4 不同氮源對靈芝液體發(fā)酵胞外多糖的影響

表5 起始氮源濃度對菌絲體生物量和胞外多糖產(chǎn)量的影響

表2～表5的結(jié)果說明：葡萄糖、玉米粉和小麥粉都是較好的碳源，其含量對靈芝胞外多糖的積累隨著濃度的增加而增大，繼續(xù)增大則趨于平穩(wěn)；從生產(chǎn)實際考慮，選擇葡萄糖和玉米粉作為靈芝液體發(fā)酵培養(yǎng)基的復(fù)合碳源。酵母粉和豆餅粉都是較好的氮源，其含量對多糖的積累隨著濃度的增大而增大，繼續(xù)增到一定值反而降低；從生產(chǎn)實際考慮，豆餅粉價格低廉，容易獲得，因此選擇豆餅粉作為靈芝液體發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源。

2.2 響應(yīng)面分析試驗結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果

根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計原理，設(shè)計3因素3水平的響應(yīng)面分析試驗。共有17個試驗點，其中12個為析因點，5個零點試驗用以估計試驗誤差。以胞外多糖得率為響應(yīng)值，試驗方案及結(jié)果見表6。

表6 響應(yīng)面試驗設(shè)計方案及試驗結(jié)果

2.2.2 回歸模型建立及方差分析

利用Design Expert 8.05軟件對表6實驗數(shù)據(jù)進行分析[7]，獲得靈芝胞外多糖得率對葡萄糖、玉米粉和豆餅粉的多元二次回歸方程：EPS(mg·L-1)=341.36+4.81X1+8.61X2+22.55X3-6.95X1X2+12.28X1X3-9.36X2X3-37.26X1X1-19.97X2X2-19.96X3X3

表7 回歸模型方差分析

由表7方差分析可知，以胞外多糖含量為目標函數(shù)的回歸方程的回歸效果達到極顯著水平，P值均<0.0001；模型的決定系數(shù)R2=0.9879，說明模型與實際實驗擬合較好；校正決定系數(shù)AdjR2=0.9724，說明該模型能解釋97.24%響應(yīng)值的變化；模型的失擬項表示模型預(yù)測值與實際值不擬合的概率，表7中模型失擬項的P值為0.0956，大于0.05，表明模型的失擬項不顯著；根據(jù)表7的顯著性分析結(jié)果，各因素的一次項、二次項以及X1X2、X1X3、X2X3的交互項對胞外多糖的合成均顯著(P<0.05)影響；綜合以上表明這個模型建立的回歸方程能運用于靈芝液體發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化的理論預(yù)測。

2.2.3 響應(yīng)面圖形分析

分別將模型中的葡萄糖、玉米粉及豆餅粉的其中一個因素固定在0水平，得到另外兩個因素的交互影響結(jié)果，二次回歸方程的響應(yīng)面及其等高線如圖1～3所示，各個因素及其相互間的交互作用對響應(yīng)值的影響結(jié)果通過該組圖可以直觀地反映出來。極值條件應(yīng)該在等高線的圓心處。由幾組圖可以看出，影響靈芝發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖最顯著的因素為葡萄糖(X1)，表現(xiàn)為響應(yīng)面變化弧度較大。玉米粉(X2)和豆餅粉(X3)響應(yīng)面弧度變化平緩，說明對響應(yīng)值影響相對較小。此外，等高線的形狀可反映出交互效應(yīng)的強弱，橢圓形表示二因素交互作用顯著，而圓形則與之相反。從圖1～圖3可以看出，X1與X3交互作用顯著；X2與X3，X1與X2均無交互作用，表明一因素對響應(yīng)值的影響規(guī)律并不會隨著另一因素的改變而有明顯變化。

圖1 葡萄糖和玉米粉交互影響胞外多糖得率的曲面圖和等高線圖

圖2 葡萄糖和豆餅粉交互影響胞外多糖得率的曲面圖和等高線圖

圖3 玉米粉和豆餅粉交互影響胞外多糖得率的曲面圖和等高線圖

2.2.4 驗證實驗

通過SAS軟件對上述方程進行求解，得到最佳培養(yǎng)條件為：葡萄糖15.79g/L，玉米粉10.23g/L，豆餅粉10.41 g/L，胞外多糖產(chǎn)量理論值可達348.75mg/L。

為檢驗?zāi)Ｐ皖A(yù)測值與實際實驗值之間的相關(guān)性，即檢驗響應(yīng)面優(yōu)化模型的可靠性，對靈芝在預(yù)測的最優(yōu)發(fā)酵條件下胞外多糖產(chǎn)量進行實驗驗證。實驗中葡萄糖、玉米粉和豆餅粉的優(yōu)化值分別為15.79、10.23、10.41g/L，三組平行實驗，測得胞外多糖產(chǎn)量分別為338.79mg/L、341.04mg/L、340.32mg/L，實際胞外多糖平均值為340.05mg/L，達到了回歸模型預(yù)測理論值的97.5%，實驗結(jié)果與模型符合良好，說明該模型能較好地模擬和預(yù)測靈芝胞外多糖產(chǎn)量。

3 結(jié)論

考察了不同碳、氮源營養(yǎng)因子的影響，結(jié)合工業(yè)化生產(chǎn)實踐，選擇葡萄糖和玉米粉為碳源，豆餅粉為氮源，根據(jù)Box-Benhnken中心組合實驗設(shè)計及三因素三水平的響應(yīng)面分析，通過二次多項回歸模型進行方差分析和回歸擬合，預(yù)測了靈芝產(chǎn)胞外多糖最佳培養(yǎng)基條件為：葡萄糖15.79g/L，玉米粉10.23g/L，豆餅粉10.41g/L，胞外多糖產(chǎn)量理論值可達348.75mg/L。驗證實驗中胞外多糖可得340.05mg/L，與預(yù)測值十分接近，證明了該實驗方法的穩(wěn)定性。

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