歐陽彬 李 江 魏玲玲 鄢盛愷，▲

1.廣東省河源市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東河源 517000；2.中日友好醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100029；3.北京豪邁生物工程有限公司，北京 101318

糖化清蛋白（glycated albumin，GA）由于本身成分的單一，其測(cè)定克服了糖化血清蛋白（GSP）檢測(cè)方法學(xué)的缺陷，可以作為一個(gè)短期血糖監(jiān)測(cè)（1～2周）的可靠性指標(biāo)，是糖化血紅蛋白（HbA1c）測(cè)定的有益補(bǔ)充[1]。近年來，GA在糖尿病患者，尤其是妊娠糖尿病患者的血糖監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用日益廣泛。目前國內(nèi)外市場(chǎng)上與主流全自動(dòng)生化分析儀配套使用的GA檢測(cè)試劑并不多見，而眾多國內(nèi)從事體外診斷（IVD）檢測(cè)試劑生產(chǎn)的廠家，并不生產(chǎn)與之匹配的檢測(cè)儀器。對(duì)此，臨床實(shí)驗(yàn)室在使用全自動(dòng)生化分析儀開放通道與開放試劑配套構(gòu)成的檢測(cè)系統(tǒng)之前，必須驗(yàn)證檢測(cè)系統(tǒng)的精密度、準(zhǔn)確度、可報(bào)告范圍、參考區(qū)間等檢測(cè)性能指標(biāo)，以證明構(gòu)成的檢測(cè)系統(tǒng)性能與試劑廠商聲明的一致，符合臨床實(shí)際要求[2]，而驗(yàn)證這些性能指標(biāo)也是目前實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可（ISO 15189）過程中的重要技術(shù)要求之一。本文參照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（CLSI）頒布的標(biāo)準(zhǔn)化文件及其他文獻(xiàn)方法[3-4]，對(duì)北京豪邁生物工程有限公司（以下簡(jiǎn)稱“豪邁”）自主研發(fā)生產(chǎn)的血清GA試劑盒[1]與美國貝克曼庫爾特有限公司生產(chǎn)的AU2700全自動(dòng)生化分析儀（以下簡(jiǎn)稱“AU2700生化分析儀”）組成的配套檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行性能驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 材料

采集2013年10～12月廣東省河源市人民醫(yī)院及中日友好醫(yī)院門診、住院患者和正常健康體檢者的血清樣本，混合成正常水平（GA水平11%～16%）和異常水平（GA水平＞16%）的混合新鮮血清各50 mL；收集異常高濃度（GA水平 ＞65%）血清樣本混合成高值新鮮血清，濃度接近或高于線性檢測(cè)范圍（5 mL）；采集健康體檢者新鮮血清樣本，男女各40份，每份1 mL。

1.2 試劑與儀器

豪邁GA檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：HX006、HX005、HX004）。 豪邁 GA 校準(zhǔn)品（批號(hào)：HX006、HX005），貝克曼庫爾特AU2700全自動(dòng)生化分析儀及配套用清洗劑。

1.3 方法

按照試劑說明書中參數(shù)設(shè)定儀器參數(shù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析，每天測(cè)定2個(gè)水平的常規(guī)質(zhì)控品，按實(shí)驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)控規(guī)則判斷質(zhì)控在控后，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析。

1.3.1 準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)一：使用當(dāng)前校準(zhǔn)品校準(zhǔn)檢測(cè)體系，選取與當(dāng)前校準(zhǔn)品批號(hào)不同的另一校準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)，與試劑廠商提供的校準(zhǔn)品說明書對(duì)照，計(jì)算相對(duì)偏差[5]；實(shí)驗(yàn)二：回收試驗(yàn)，將不超過總體積10%的校準(zhǔn)品溶液加入混合新鮮血清樣本中，測(cè)定計(jì)算得出回收率[6]。

1.3.2 精密度實(shí)驗(yàn)

依據(jù)CLSI的EP15-A2文件中的實(shí)驗(yàn)方案，驗(yàn)證豪邁GA試劑盒與貝克曼庫爾特AU2700全自動(dòng)生化分析儀共同構(gòu)成的檢測(cè)系統(tǒng)的精密度，每天分析1個(gè)批次樣本，每批次2個(gè)濃度，每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)定3次，連續(xù)測(cè)定5 d，計(jì)算批內(nèi)精密度[7]。同時(shí)測(cè)定3個(gè)批次試劑，2個(gè)濃度，每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)定3次，計(jì)算批間精密度，進(jìn)而計(jì)算批內(nèi)和批間變異系數(shù)（CV），并與試劑廠家聲明的批內(nèi)CV和批間CV進(jìn)行比較。

1.3.3 可報(bào)告范圍[8]

1.3.3.1 線性范圍 選擇檢測(cè)結(jié)果達(dá)到或接近廠家聲明的線性范圍上限（H）及下限（L）的新鮮血清，制成高值和低值混合樣本，低值為1號(hào)樣本，高值為6號(hào)樣本。二者以4∶1的比例混勻?yàn)?號(hào)樣本，兩者3∶2混勻?yàn)?號(hào)樣本，2∶3混勻?yàn)?號(hào)樣本，1∶4混勻?yàn)?5號(hào)樣本，混合成6份濃度不同的樣本，每個(gè)濃度的樣本重復(fù)測(cè)定2次。以預(yù)期值為±，測(cè)定均值為Y，計(jì)算回歸方程為Y=bX+a。

1.3.3.2 可報(bào)告范圍 依據(jù)試劑廠家聲明的稀釋液和稀釋倍數(shù)，收集3份濃度在線性范圍內(nèi)的高值新鮮血清樣本，稀釋后分別測(cè)定，計(jì)算其稀釋回收率。

1.3.4 參考區(qū)間驗(yàn)證

選擇體檢健康者，年齡18～61歲，男、女新鮮血清樣本各40份，按照CLSI頒布的C28-A2文件中的實(shí)驗(yàn)方案[9]進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證廠商聲明的參考區(qū)間的正確性。

2 結(jié)果

2.1 準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)

2.1.1 校準(zhǔn)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

使用批號(hào)為HX006的校準(zhǔn)品對(duì)當(dāng)前檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行校準(zhǔn)，對(duì)批號(hào)為HX005的校準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)照被測(cè)校準(zhǔn)品說明書，計(jì)算相對(duì)偏差，檢測(cè)值1為20.0%，檢測(cè)值2為20.2%，平均值為20.1%，低于預(yù)期值（20.6），相對(duì)偏差為2.4。GA校準(zhǔn)品的相對(duì)偏差為2.4%。廠家的聲明是，相對(duì)偏差應(yīng)在±15%范圍內(nèi)，相對(duì)偏差小于廠家聲明，符合要求。

2.1.2 回收實(shí)驗(yàn)

分別將批號(hào)為 HX006 的校準(zhǔn)品 20 μL、50 μL 和100 μL加入1000 μL正?；旌闲迈r血清中，校準(zhǔn)品的標(biāo)示值為20.6%，分別計(jì)算回收率。結(jié)果顯示，3個(gè)樣本的回收率分別為104.1%、107.9%和103.2%，均在試劑廠商標(biāo)示的90.0%～110.0%范圍內(nèi)，表明由豪邁GA試劑盒與AU2700生化分析儀組成的檢測(cè)系統(tǒng)的準(zhǔn)確度符合要求。

2.2 精密度實(shí)驗(yàn)

每天分析1個(gè)批次，2個(gè)濃度的樣本，每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)定3次，連續(xù)測(cè)定5 d，計(jì)算批內(nèi)精密度。同時(shí)使用3個(gè)批次試劑，2個(gè)濃度，每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)定3次，計(jì)算批間精密度。低值樣本測(cè)定均值為13.4%，驗(yàn)證的CV批內(nèi)=2.42%，CV批間=2.98%，高值樣本測(cè)定均值為 24.6%，驗(yàn)證的 CV批內(nèi)=1.67%，CV批間=1.89%，廠家聲明的CV批內(nèi)≤5%，CV批間≤15%，均在廠家聲明的允許范圍內(nèi)。見表2。

表2 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果（%）

2.3 臨床可報(bào)告范圍

2.3.1 線性范圍

選取測(cè)定值為3.23%的低值樣本和測(cè)定值為67.50%的高值樣本，按不同比例混合，配置成系列濃度血清，并進(jìn)行雙份測(cè)定。以驗(yàn)證試劑廠商聲明的GA試劑盒的線性范圍為3.20%～68.00%。見表3。

表3 線性范圍驗(yàn)證（%）

2.3.2 可報(bào)告范圍

收集高值血清樣本3份，濃度在已經(jīng)驗(yàn)證的GA測(cè)量范圍內(nèi)，用試劑廠商推薦的生理鹽水作為稀釋液，進(jìn)行最大2倍稀釋，分別重復(fù)測(cè)定3次，計(jì)算3份樣本的稀釋回收率。結(jié)果顯示，3份樣本的稀釋回收率分別為98.12%、96.86%和95.17%，均符合試劑廠商聲明的90%～110%的要求范圍，故驗(yàn)證的臨床可報(bào)告范圍符合試劑廠商的3.2%～68.0%。

2.4 參考區(qū)間

40份健康成年人新鮮血清樣本測(cè)定結(jié)果顯示，所有檢測(cè)值均在試劑廠商提供的參考區(qū)間之內(nèi)（11%～16%），考慮到本實(shí)驗(yàn)室的服務(wù)人群與廠商提供參考區(qū)間的人群相近，檢測(cè)方法具有可比性，故采用試劑廠商提供的參考區(qū)間進(jìn)行臨床應(yīng)用是符合實(shí)際需求的。

3 討論

根據(jù)目前國內(nèi)外普遍的做法及實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可的相關(guān)要求，在用于臨床檢驗(yàn)之前，對(duì)于實(shí)驗(yàn)室自己構(gòu)建，或是配套生化檢測(cè)系統(tǒng)應(yīng)進(jìn)行評(píng)估并確認(rèn)相關(guān)性能參數(shù)，包括準(zhǔn)確度、精密度、可報(bào)告范圍和參考區(qū)間，以保證所構(gòu)建的檢測(cè)系統(tǒng)符合臨床要求，證實(shí)其可以給出滿意的測(cè)定結(jié)果。利用簡(jiǎn)便、有效的方法驗(yàn)證廠家聲明的性能參數(shù)，并對(duì)所用檢驗(yàn)系統(tǒng)和程序進(jìn)行評(píng)價(jià)，這也是實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理體系中的重要組成部分[10]。

本實(shí)驗(yàn)采用兩種方式驗(yàn)證所構(gòu)建系統(tǒng)的準(zhǔn)確度，包括系統(tǒng)間比對(duì)試驗(yàn)和系統(tǒng)內(nèi)有證參考品來驗(yàn)證。本研究中，采用廠家提供定值校準(zhǔn)品進(jìn)行測(cè)定及回收實(shí)驗(yàn)進(jìn)行準(zhǔn)確度驗(yàn)證，用以驗(yàn)證豪邁GA檢測(cè)試劑盒與AU2700生化分析儀組合構(gòu)成的檢測(cè)系統(tǒng)準(zhǔn)確度。結(jié)果顯示，通過校準(zhǔn)后的檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)試劑廠商生產(chǎn)的校準(zhǔn)品進(jìn)行測(cè)定的相對(duì)偏差為2.4%。符合所聲明的相對(duì)偏差應(yīng)在±15%范圍內(nèi)。使用3個(gè)水平校準(zhǔn)品的進(jìn)行回收試驗(yàn)，回收率分別為104.1%、107.9%和103.2%，均在廠商聲明的90%～110%范圍內(nèi)。通過上述兩個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，顯示本檢測(cè)系統(tǒng)準(zhǔn)確度符合要求。

通過精密度實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證得到的批內(nèi)和批間CV均低于試劑廠商說明書標(biāo)示的標(biāo)準(zhǔn)，低值樣本測(cè)定均值為 13.4%，驗(yàn)證的 CV批內(nèi)=2.01%，CV批間=2.13%，高值樣本測(cè)定均值為24.6%，驗(yàn)證的CV批內(nèi)=1.22%，CV批間=1.38%，均在廠家聲明的CV批內(nèi)≤5%、CV批間≤ 15%的允許范圍內(nèi)，說明本檢測(cè)系統(tǒng)具有良好的精密度。

采用不同稀釋比例制成的不同濃度的系列樣本進(jìn)行線性范圍驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)試劑廠商聲明的線性范圍（3.20%～68.00%）及最大稀釋倍數(shù)實(shí)用可靠，表3結(jié)果顯示，線性回歸方程為Y=0.986X-1.005，r2=0.998，斜率在0.97～1.03之間，截距接近于0，可認(rèn)為該檢測(cè)系統(tǒng)在線性范圍內(nèi)具有良好的線性檢測(cè)性能，所以可以使用生理鹽水稀釋超出線性分析范圍的樣本。按試劑說明書推薦的方法對(duì)3份高值樣本進(jìn)行稀釋測(cè)定并計(jì)算回收率，顯示3份樣本的回收率分別為98.12%、96.86%和95.17%，均符合試劑廠商聲明的90%～110%范圍，說明試劑說明書所標(biāo)示的線性范圍正確有效。

正確可靠的參考區(qū)間是臨床實(shí)驗(yàn)室開展常規(guī)檢測(cè)工作的必要條件之一，也是臨床實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可工作的基本要求。通?？梢愿鶕?jù)專業(yè)教科書或廠商說明書等資料制定參考區(qū)間，但使用不同檢測(cè)系統(tǒng)之前應(yīng)進(jìn)行參考區(qū)間驗(yàn)證，看是否可作為臨床實(shí)驗(yàn)室實(shí)際使用的參考區(qū)間。試劑廠商提供的中國人群的GA參考區(qū)間為11%～16%，考慮到本實(shí)驗(yàn)室的服務(wù)人群與豪邁廠家建立參考區(qū)間的人群相近，檢測(cè)方法具有可比性，通過驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明，40例樣本的檢測(cè)值均在試劑廠商提供的參考區(qū)間（11%～16%）之內(nèi)，所以采用此參考區(qū)間作為臨床實(shí)驗(yàn)室實(shí)際應(yīng)用符合要求。

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，由豪邁GA檢測(cè)試劑盒和與貝克曼庫爾特AU2700生化分析儀構(gòu)成的配套檢測(cè)系統(tǒng)的性能指標(biāo)，包括準(zhǔn)確度、精密度、線性范圍和臨床可報(bào)告范圍，均與豪邁公司試劑說明書聲明的一致，也說明豪邁公司提供的參考區(qū)間可以轉(zhuǎn)移使用。上述驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明，本自建檢測(cè)系統(tǒng)的性能可以滿足臨床需求，所采用的驗(yàn)證方案簡(jiǎn)便、可行，可推廣用于臨床生化定量檢測(cè)工作中對(duì)于各種類型自建或配套檢測(cè)系統(tǒng)的性能驗(yàn)證。

[1]劉常同，黃萍.糖化清蛋白在糖尿病早期診斷中的應(yīng)用價(jià)值[J].現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2012，27（5）：121-123.

[2]U.S.Department of Health and human services，centers for medicare&medicaid services.Clinical laboratory improvement amendments of 1988：final rule [S].Fed Register，2003：3704.

[3]黃小兵，劉光明，張偉堅(jiān).羅氏全自動(dòng)生化分析儀自建生化檢測(cè)系統(tǒng)的性能驗(yàn)證及評(píng)價(jià)[J].海南醫(yī)學(xué)，2013，24（16）：2417-2419.

[4]何國堅(jiān)，胡勁輝，肖慶.半胱氨酸蛋白酶抑制劑C透射比濁檢測(cè)試劑盒性能驗(yàn)證[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2013，10（23）：3155-3157.

[5]張葵.定量檢測(cè)系統(tǒng)方法學(xué)性能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的基本方法[J].臨床檢驗(yàn)雜志，2009，27（5）：1047-1049.

[6]王治國.臨床檢驗(yàn)方法確認(rèn)與性能驗(yàn)證[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2009：242-297.

[7]Clinical and Laboratory Standards Institute.User verification of performance for precision and trueness：approved guideline second edition[S].EP15-A2（e），CLSI，2005.

[8]楊有業(yè)，張秀明.臨床檢驗(yàn)方法學(xué)評(píng)價(jià)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2009：175-195.

[9]CLSI.C28-A2.How to define and determine reference intervals in the clinical laboratory[S].Approved Guideline-Second Edition，2000.

[10]王治國.臨床檢驗(yàn)方法確認(rèn)與性能驗(yàn)證[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2009：242-297.