王 強(qiáng)，張玉寶，梁宏斌，斯琴圖雅，蔣繼成，張春靜

(1.黑龍江省科學(xué)院 技術(shù)物理研究所，哈爾濱 150086；2.哈藥集團(tuán)世一堂制藥廠，哈爾濱 150078)

植物性中藥材的有效成分多被包裹在細(xì)胞壁內(nèi)，目前采用的提取方式多為傳統(tǒng)的溶劑提取法[1]，如煎煮法、回流法、浸漬法、滲漉法等，大多利用溶媒進(jìn)入藥材細(xì)胞內(nèi)溶解或分散有效成分，并將其轉(zhuǎn)變成浸出液，即有效成分的固-液擴(kuò)散過(guò)程.這個(gè)過(guò)程包含浸潤(rùn)、滲透、溶解擴(kuò)散、置換階段，將有效成分由藥材細(xì)胞內(nèi)帶入溶液中需要通過(guò)細(xì)胞壁這一屏障，因此提取效率較低.

電子束是由電子加速器產(chǎn)生并加速的高能粒子束.本文利用電子束輻照能夠使細(xì)胞壁、紋孔膜等薄弱組織破裂的特性，對(duì)黃連藥材進(jìn)行提取前輻照預(yù)處理，使其細(xì)胞壁破裂，為在相同提取條件下，不改變藥材的化學(xué)穩(wěn)定性，提高有效成分的溶出率提供相應(yīng)的藥學(xué)研究資料，為中藥提取預(yù)處理提供一種綠色環(huán)保，簡(jiǎn)單易操作的研究新路線.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

安捷倫高效液相色譜儀(Agilent1100型)，電子天平(XS105型)，超聲波提取器(GT-350W 型)，循環(huán)水式多用真空泵(SHB-Ⅲ型)，實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)(PHSJ-4)，鹽酸小檗堿，甲醇，磷酸，鹽酸，磷酸二氫鉀，乙腈，十二烷基硫酸鈉(SDS)，其中十二烷基硫酸鈉(SDS)為化學(xué)純，乙腈為色譜純，其余試劑為分析純.

1.2 電子束輻照

稱取黃連藥材，粉碎后過(guò)二號(hào)篩，藥用PE封口袋封裝，每袋10 g，厚度0.3 cm，分別以劑量2、10、20、30、40、50、100、150 kGy劑量進(jìn)行輻照，電子束能量為1 MeV，劑量率為0.67 kGy/s.

1.3 黃連藥材有效成分溶出率檢測(cè)

依據(jù)《中國(guó)藥典》2010年版一部及其附錄對(duì)輻照前后黃連藥材進(jìn)行有效成分溶出率檢測(cè)[2]，并將檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析.

1.4 繪制指紋圖譜

色譜條件Alltima-C18色譜柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流動(dòng)相為乙腈-50 mmol/L磷酸二氫鉀溶液(磷酸調(diào)pH值為3.0)(50∶50)，內(nèi)含濃度為12.5 mmol/L 的SDS；檢測(cè)波長(zhǎng)345 nm；流速1 mL/min；柱溫為室溫；進(jìn)樣量10 μL；理論板數(shù)按鹽酸小檗堿計(jì)約為1.8×104.

對(duì)照品溶液：取鹽酸小檗堿對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mg含90.5 μg的溶液，即得.

供試品溶液：精密稱取不同批次黃連藥材粉末，具塞錐形瓶中，精密加入甲醇-鹽酸(100∶1)的混合溶液50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液2 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得[3].根據(jù)黃連化學(xué)成分的文獻(xiàn)報(bào)道[4]，并結(jié)合對(duì)照品進(jìn)行分析，確定黃連藥材HPLC圖譜中各主要色譜峰，如圖1.

峰2—5-OH小檗堿；峰3—非洲防己堿；峰4—藥根堿；峰5—表小檗堿；峰 6—黃連堿；峰7—巴馬汀峰8—小檗堿

2 實(shí)驗(yàn)分析

2.1 黃連有效成分溶出率分析

采用《中國(guó)藥典》2010年版一部黃連項(xiàng)下檢測(cè)方法測(cè)定黃連有效成分，測(cè)定結(jié)果及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析見(jiàn)表1～5，有效成分溶出率變化情況見(jiàn)表6.

表1 輻照前后黃連藥材有效成分測(cè)定結(jié)果(n=3)

表2 輻照后小檗堿溶出率變化統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

注：-為無(wú)統(tǒng)計(jì)意義，+為有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.05)，*為有高度統(tǒng)計(jì)意義(P<0.01)

表3 輻照后表小檗堿溶出率變化統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

注：-為無(wú)統(tǒng)計(jì)意義，+為有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.05)，*為有高度統(tǒng)計(jì)意義(P<0.01)

表4 輻照后黃連堿溶出率變化統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

注：-為無(wú)統(tǒng)計(jì)意義，+為有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.05)，*為有高度統(tǒng)計(jì)意義(P<0.01)

表5 輻照后巴馬汀溶出率變化統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

注：-為無(wú)統(tǒng)計(jì)意義，+為有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.05)，*為有高度統(tǒng)計(jì)意義(P<0.01)

表6 輻照后黃連藥材有效成分溶出率變化情況

結(jié)果顯示，有效成分溶出率RSD(%)均在2.0%以下，以2-50 kGy劑量電子束輻照黃連藥材，小檗堿及巴馬汀的溶出率均有顯著變化(P<0.05)，其中40 kGy為最優(yōu)輻照劑量，以此劑量輻照黃連，經(jīng)檢測(cè)，小檗堿的溶出率增加8.46%，巴馬汀的溶出率增加9.68%.而隨著輻照劑量的進(jìn)一步增加，黃連中小檗堿及巴馬汀溶出率的增幅逐漸變小.

2.2 黃連藥材指紋圖譜分析

取三組黃連藥材平行樣品進(jìn)行40 kGy電子束輻照，并比對(duì)指紋圖譜.未輻照平行樣品標(biāo)記為a、b、c，輻照樣品標(biāo)記為1、2、3.圖2為輻照前后黃連藥材指紋圖譜，分析結(jié)果顯示見(jiàn)表7，以40 kGy電子束輻照黃連藥材，各樣品指紋圖譜相似度均在0.99以上，表明該劑量下輻照未影響黃連藥材化學(xué)結(jié)構(gòu)，亦無(wú)新物質(zhì)生成，輻照后黃連藥材化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性良好.

圖2 電子束輻照(40kGy)前后黃連藥材指紋圖譜分析報(bào)告(n=3)

樣品a樣品b樣品c樣品1樣品2樣品3對(duì)照指紋圖譜樣品a10.9960.9970.9970.9960.9960.999樣品b0.99610.9960.9970.9970.9960.999樣品c0.9970.99610.9970.99710.998樣品10.9970.9970.99710.9970.9980.999樣品20.9960.9970.9970.99710.9990.999樣品30.9960.99610.9980.99910.998對(duì)照指紋圖譜0.9990.9990.9980.9990.9990.9981

2.3 黃連藥材掃描電鏡對(duì)比分析

圖3、4分別為輻照前后黃連藥材掃描電鏡顯微圖，輻照前黃連細(xì)胞壁完整無(wú)裂痕，輻照后黃連細(xì)胞壁出現(xiàn)多處破裂，如圖4中箭頭標(biāo)記處，可見(jiàn)電子束輻照對(duì)黃連藥材的細(xì)胞壁具有破壞作用，經(jīng)40kGy劑量電子束輻照后細(xì)胞壁破裂，從而形成新的流體通道，能夠提高有效成分的溶出率.

圖3 電子束輻照前黃連藥材顯微圖

圖4 40kGy劑量電子束輻照后黃連藥材顯微圖

3 結(jié)果與討論

利用1MeV的電子束，以劑量率0.67kGy/s，2kGy～50kGy的劑量輻照黃連藥材，對(duì)黃連的細(xì)胞壁具有破壞作用，且通過(guò)輻照前后指紋圖譜的對(duì)比，顯示電子束輻照未影響黃連藥材化學(xué)結(jié)構(gòu)，亦無(wú)新物質(zhì)生成，輻照后黃連藥材化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性良好.經(jīng)輻照的黃連藥材細(xì)胞壁上形成的細(xì)胞間新的流體通道能夠顯著提高其有效成分小檗堿及巴馬汀的溶出率，其中40kGy為最優(yōu)輻照劑量，經(jīng)此劑量輻照后，黃連藥材中小檗堿的溶出率增加8.46%，巴馬汀的溶出率增加9.68%.

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中隨著輻照劑量的逐步增大，小檗堿及巴馬汀的溶出率增幅反而逐漸下降，初步分析，產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是由于電子束輻照劑量的增大，隨著輻照時(shí)間的增加，使產(chǎn)生的熱量逐漸積聚，并未及時(shí)導(dǎo)出，熱能使藥材細(xì)胞輕度脫水，從而使作為流體形式溶出的有效成分流動(dòng)性變差，最終造成溶出率增幅降低.

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[3] 趙 楊, 靳風(fēng)云, 廖 薇, 等. HPLC法測(cè)定990康泰寶血療貼中鹽酸小檗堿的含量[J]. 貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2007, 29(2): 71-72.

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