葛明明，繆月英，孫麗娜，李國清，胡 北，高金波

（1.黑龍江省教育廳生物藥制劑重點實驗室，佳木斯大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 佳木斯154007；2.黑河學(xué)院物理化學(xué)系，黑龍江 黑河164300；3.哈爾濱學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150017）

蒲公英屬菊科多年生草本植物，蒲公英植物體內(nèi)含有胡蘿卜素類［1］、三萜類［2］、植物甾醇類、酚酸類、黃酮類［3］、等多種成 分［4～6］，有 抗 腫 瘤［7］、免 疫［8］、抗 菌［9］、抗 氧 化［10］、利膽［11］等功效。還可生吃、炒食、做湯。在生命活動中，由于氧化代謝過程中不斷產(chǎn)生多種自由基，這些自由基一方面是生物體多種生理功能的啟動因素和生化反應(yīng)的介導(dǎo)者，另一方面也在免疫細胞因子網(wǎng)絡(luò)中起調(diào)節(jié)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等作用［12］。隨著年齡的增長，自由基的自穩(wěn)態(tài)平衡作用在機體內(nèi)不斷下降，從而導(dǎo)致生命自身免疫功能的下降，這一下降可導(dǎo)致機體發(fā)生惡性腫瘤、原發(fā)性高血壓、動脈粥樣硬化、Alzheimer型早老性癡呆、糖尿病等自由基疾?。?3］。有研究表明：從各種生物體內(nèi)提取的多糖物質(zhì)均具有提高機體免疫力、可抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗寄生蟲、還能延緩衰老等一系列作用，在食品、醫(yī)藥和保健品等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用［14，15］，因為蒲公英根中富含多糖［16］。所以本實驗經(jīng)摸索后以超聲波協(xié)同酶法從蒲公英根中提取多糖，并在研究了多糖的提取工藝、結(jié)構(gòu)、單糖組成分析的基礎(chǔ)上［17，18］，對其多糖進行抗氧化活性測定，以期待對蒲公英的進一步的應(yīng)用開發(fā)等提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蒲公英根夠置于河北省安國市京華藥業(yè)有限公司，經(jīng)由佳木斯大學(xué)生藥學(xué)教研室教授劉娟鑒定為蒲公英根；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH自由基）美國Sigma公司；抗壞血酸（Vc）、番紅花紅T、鄰苯三酚、三羥甲基氨基甲烷、硫酸亞鐵、30%過氧化氫等均為國產(chǎn)分析純，甲醇。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1100高效液相色譜系統(tǒng)（配有自動進樣器，可變波長紫外檢測器和REV.A.06.03色譜工作站）美國安捷倫公司；UV 757型紫外分光光度計 上海精密科學(xué)儀器有限公司；TGL-10B高速臺式離心機。

1.3 工作曲線的繪制

分別吸取濃度為0.5mg／m L的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0m L，以蒸餾水稀釋至50m L的容量瓶中。各精密吸取1.0mL置干凈的試管中，各管加入5%的苯酚1m L，混勻，迅速加入濃硫酸7.00m L，搖勻，靜置5min后，放入85℃水浴中加熱20min，取出冷卻至室溫，在490nm處測定吸光度，并以濃度（C：μg／m L）為橫坐標(biāo)，以吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算相關(guān)系數(shù)。

1.4 多糖的提取及含量測定

1.4.1 蒲公英根中多糖的提取

蒲公英根→粉碎→過篩→石油醚、95%的乙醇回流脫脂、脫低聚糖→50℃熱風(fēng)干燥→稱取適量的蒲公英根+提取液（料液比=1：40）+纖維素酶，在一定的溫度下，超聲波提取→濃縮至總體積的1／3→Sevage法除去游離蛋白→大孔吸附樹脂脫色→終濃度為75%的乙醇沉淀→重蒸餾水重新溶解→終濃度為75%乙醇沉淀→低溫干燥→蒲公英根多糖→過Sephadex-75柱精制。

1.4.2 多糖含量的測定

采用苯酚-硫酸法［19］進行多糖的含量測定。

1.5 羥基自由基的生成和清除率的測定

利用Fenton反應(yīng)體系［20］，檢測多糖提取物對羥基自由基清除作用。取0.15mol／L的磷酸緩沖溶液（p H=7.4）1.00m L，0.262mg／m L番紅花紅 T 溶液0.20m L，6mmol／L的EDTA-Na+Fe2+1.00m L，然后分別加入7.00m L不同質(zhì)量濃度 （0.02mg／mL，0.04mg／m L，0.06mg／mL，0.08mg／mL，0.1mg／mL）的多糖，后加入0.8mL的3%的過氧化氫，放入40℃水浴30min后，在520nm處的測吸光度值。配制相同濃度的VC溶液，根據(jù)以上實驗方法，進行實驗。其清除率可用下式計算：

式中：A1—體系中未加樣品溶液時的吸光度；AS—體系中加了樣品溶液時的吸光度；A2—番紅花紅和緩沖溶液混合后的吸光度。

1.6 超氧陰離子自由基的生成和清除率的測定

加入3.00m L的Tris-HC1緩沖溶液（p H=8.2）和0.10m L不同濃度的樣品溶液，25℃水浴20min，加入濃度為7mmol／L的鄰苯三酚溶液3.00m L，反應(yīng)4min，再加入10mol／L的HCl終止反應(yīng)，以蒸餾水作參比，在420nm處測吸光度值，同時以VC作對照。其清除率可用下列公式計算：

式中：A1—為樣品加入緩沖溶液及鄰苯三酚后的吸光度；A2—樣品加入緩沖溶液后的吸光度；A0為緩沖溶液加入鄰苯三酚后的吸光度。

1.7 HPLC法測定DPPH·自由基的生成與清除率

1.7.1 色譜條件

色 譜 柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18，250mm ×4.6mmi.d.；流動相：甲醇∶水=80∶20；柱溫：25℃；流速：1.0mL·min-1，檢測波長517nm。

1.7.2 HPLC法測定清除DPPH·自由基

取多糖試樣液2.00m L及DPPH乙醇溶液2.00m L濃度為2×10-4mol／L，先后加入同一具塞試管中，同時做空白實驗等，置于37℃是恒溫水浴中，30min后分別測定DPPH的色譜峰面積；以VC作對照，其清除率可用下列公式計算：

式中：A0—2.00mL DPPH+2mL蒸餾水時測定DPPH的色譜峰面積；A1—2mL DPPH+2mL多糖溶液時測定DP-PH的色譜峰面積；A2—2m L多糖溶液+2m L乙醇時測定DPPH的色譜峰面積。

2 結(jié)果與分析

2.1 蒲公英多糖提取的正交實驗設(shè)計及實驗結(jié)果

本實驗是在單因素考察的基礎(chǔ)上進行的［17］，以料液比1：40為固定條件，按照正交實驗設(shè)計對影響超聲波纖維素酶法提取蒲公英多糖的因素，如：提取溫度（45℃、50℃、55℃）、p H（4.5、5、5.5）、加酶量（占底物%：1%、2%、3%）、提取時間（15min、20min、25min）等，進行條件正交試驗優(yōu)化，平行3次所得結(jié)果見表1。

表1 正交試驗設(shè)計L9（34）及實驗結(jié)果（n=3）

由實驗所得的數(shù)據(jù)分析可知，影響蒲公英多糖提取率的主次關(guān)系：影響最大的是提取時間的多少，其次是提取溫度的大小，然后是p H值的大小，影響最小的是提取時所加的纖維素酶的量。結(jié)果正交實驗所獲得的最佳工藝條件為：取時間為25min，提取溫度50℃，p H值為5.0，酶量為底物的3%，多糖的提取率為：15.83%。

2.2 多糖含量測定的工作方程與含量

以葡萄糖為對照品，波長490nm處測得吸光度（A）與葡萄糖質(zhì)量濃度 （ρ）之間的回歸方程為：A=0.006ρ+0.0239，r=0.9995，線性范圍是10.0～100μg／m L，提取物中的多糖含量為83.31%。

2.3 蒲公英多糖質(zhì)量濃度對清除·OH的影響

見圖1。

圖1 蒲公英根多糖質(zhì)量濃度對·OH清除率的影響（n=3）

由圖1可知，蒲公英多糖清除·OH的作用在0～0.1mg／mL范圍內(nèi)，隨著多糖質(zhì)量濃度的增大，清除率逐漸升高；與VC的清除率比較分析，雖低于VC，但清除·OH的作用仍然較強。

2.4 蒲公英多糖質(zhì)量濃度對清除O-2·的影響

見圖2。

圖2 蒲公英根多糖質(zhì)量濃度對O-2·清除率的影響

由圖2可知，在實驗所選取的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，蒲公英根多糖與Vc相比較對O-2·的清除率具有相同趨勢，都隨著濃度的增大而升高，且蒲公英根多糖的清除率與Vc的清除率十分接近，說明蒲公英根多糖對O-2·自由基的清除很強。

2.5 DPPH測定的色譜專屬性實驗

在1.7.1色譜條件下，DPPH自由基的出峰時間為9.87min，而多糖和溶劑等在此色譜條件下無色譜峰出現(xiàn)。見圖3。

圖3 色譜圖（A：DPPH溶液；B：蒲公英根多糖溶液；C：乙醇+蒸餾水溶液）

2.6 蒲公英多糖質(zhì)量濃度對清除DPPH·的影響

見圖4。

圖4 蒲公英根多糖質(zhì)量濃度對DPPH·清除率的影響

由圖可知，蒲公英根多糖對DPPH·具有很明顯的清除作用，清除效果隨著濃度的增加而增大，當(dāng)濃度為3.0mg／m L時，蒲公英根多糖對DPPH·的清除率已高達95.4%基本與VC的清除率相同。

3 討論

本實驗在利用建立Fenton反應(yīng)體系模型測定羥基自由基時，使用了兩種方法，一種為鄰二氮菲亞鐵為顯色劑的方法，一種為番紅花紅為顯色劑的方法，實驗的結(jié)果是測定多糖的抗羥基自由基不能使用鄰二氮菲亞鐵為顯色劑，因為在反應(yīng)中會產(chǎn)生沉淀干擾吸光度的測定，即使采用離心除去沉淀的方法，但數(shù)據(jù)的重現(xiàn)性仍然較差。而使用番紅花紅T為顯色劑時，則沒有沉淀產(chǎn)生，重現(xiàn)性較好，較為適合蒲公英根多糖的清除羥基自由基的測定。本實驗的研究表明，蒲公英根多糖對O2-·、·OH和DPPH·均具有明顯的清除作用，均隨著多糖液濃度的增加而增強，有著明顯的量效關(guān)系，在清除超氧陰離子自由基時發(fā)現(xiàn)它的清除能力與VC相當(dāng)?？傊?，蒲公英根多糖對3種自由基的清除能力由強到弱總體趨勢是：O2-·＞·OH＞DPPH·。蒲公英在東北蘊藏量很大，蒲公英根中總糖含量較高，超聲波協(xié)同酶法提取的多糖的提取率為15.83%，其含糖高達83.31%有很高的應(yīng)用價值。因此，蒲公英根可以作為一種有效的自由基清除劑使用，有很好的開發(fā)和應(yīng)用的前景，將來會成為我們理想的天然抗氧化劑首選之一。

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