王 蕾，王雪紅，張華炎，汪義菲，熊 永，韓立赤

（大連大學 醫(yī)學院，遼寧 大連 116622）

0 引言

位于頜下三角的頜下腺是三大唾液腺之一，屬混合性腺。其主要功能是產(chǎn)生和分泌涎液，為無刺激狀態(tài)下涎液分泌的主要來源[1]。頭頸部惡性腫瘤放療及其他非腫瘤性頜下腺疾病均涉及到腺體結構和功能的損傷，導致口干、咀嚼吞咽困難和語言障礙等，嚴重影響患者的健康和生活質(zhì)量。組織工程重建頜下腺是目前極具前景的治療手段，如何有效地獲得大量頜下腺細胞，進而深入探討頜下腺的生理和病理機制，是需要解決的關鍵問題。本實驗通過比較組織塊法和酶消化法原代培養(yǎng)大鼠乳鼠頜下腺細胞的優(yōu)劣，尋求一種最佳的頜下腺細胞體外培養(yǎng)方法，為涎腺非腫瘤疾病的防治研究提供實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗材料及主要儀器設備

新出生3～5天Wistar大鼠乳鼠（大連大學動物中心），凈化工作臺（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司），CO2培養(yǎng)箱（Thermo Scientific，美國），倒置顯微鏡(Olympus，日本)，低速離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司），胰酶（Hyclone，美國），DMEM高糖培養(yǎng)液（Hyclone，美國），PBS緩沖液，優(yōu)質(zhì)胎牛血清（Hyclone，美國），羊抗小鼠Cytokeratin-8單克隆抗體（Santa Cruz,美國）。

1.2 研究方法

1.2.1 組織塊法培養(yǎng)大鼠乳鼠頜下腺細胞

選擇健康大鼠乳鼠，在超凈臺內(nèi)取頜下腺，在PBS緩沖液中去除頜下腺包膜及血管，并漂洗3次；在培養(yǎng)皿中將頜下腺剪切成1 mm3小塊，剪切過程中適當向組織塊滴加1～2滴DMEM高糖無血清培養(yǎng)液，以保持濕潤；用眼科剪將剪切好的20～30塊組織送入血清包被的培養(yǎng)瓶中，組織塊間距約5 mm；放置后，緩慢翻轉培養(yǎng)瓶，瓶底朝上，將培養(yǎng)瓶傾斜放置于培養(yǎng)箱中；4 h后，培養(yǎng)瓶緩慢翻轉后平放，在凈化工作臺內(nèi)加入5 mL DMEM高糖培養(yǎng)液以覆蓋組織塊，于培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。

1.2.2 酶消化法培養(yǎng)大鼠乳鼠頜下腺細胞

選擇健康大鼠乳鼠，超凈臺內(nèi)取頜下腺，PBS洗3次；將組織塊移入2 mL EP管，剪切成糊狀，加入1 mL消化液（無血清培養(yǎng)液0.5 mL+0.25%胰酶0.5 mL）；放入培養(yǎng)箱中，消化40 min，每10 min振蕩一次；消化結束，重懸細胞，移入10 mL離心管，向離心管中加入3 mLDMEM高糖培養(yǎng)液，800 rpm，5 min離心；棄上清，加入3 mL培養(yǎng)液重懸細胞，接種于培養(yǎng)瓶，DMEM高糖培養(yǎng)液補足至5 mL；將培養(yǎng)瓶放于培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。

1.2.3 細胞的傳代培養(yǎng)

細胞覆蓋瓶底80%以上時，即可進行細胞傳代。①棄去舊培養(yǎng)液，加入0.25%的胰酶1 mL消化2 min，再用3 mLDMEM高糖培養(yǎng)液終止消化；②用毛滴管吹打重懸細胞，將其移入到10 mL的離心管中，1000 rpm，5 min離心；③棄上清，加入3 mL的培養(yǎng)液重懸細胞，徹底吹打離心管壁和底部，充分重懸；④將重懸液平均移入3個培養(yǎng)瓶中，分別補足DMEM高糖培養(yǎng)液至5 mL，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 觀察細胞生長情況

利用倒置顯微鏡連續(xù)觀察原代和傳代細胞的生長情況，并拍照記錄。

1.4 細胞來源鑒定

取第二代細胞，爬片，4%多聚甲醛室溫固定20 min，PBS沖洗后用0.2%Triton X-100透化15 min，PBS沖洗，0.3%H2O2室溫孵育30 min阻斷內(nèi)源過氧化物酶，再用PBS沖洗，20%的馬血清室溫封閉20 min后加入細胞角蛋白-8，置濕盒中4°C過夜。經(jīng)PBS沖洗后加入生物素標記的二抗室溫孵育2 h，PBS沖洗后加入辣根酶標記的三抗室溫孵育 30 min，PBS沖洗后用DAB顯色，鏡下控制反應強度，PBS沖洗后甘油封片。

2 結果

2.1 形態(tài)學觀察結果

組織塊法原代培養(yǎng)2天后，少量細胞從組織塊中游離出來，不均勻分布；3天后，組織塊周圍游離出較多細胞，以組織塊為中心呈放射狀排列分布，初步形成了腺泡、腺管樣結構，但覆蓋范圍較小，不能進行傳代。酶消化法原代培養(yǎng)2天后，約3/4的培養(yǎng)瓶底部覆蓋了大量分布不均的細胞；4天后，細胞完全覆蓋整個培養(yǎng)瓶底，并出現(xiàn)復層生長，形成了腺泡、腺管樣結構，可傳代培養(yǎng)。

傳代后，兩種方法獲得的細胞均出現(xiàn)了3種形態(tài)。第一種為圓亮、界限清晰且無胞質(zhì)突起的圓形亮細胞；第二種為扁平、數(shù)量及胞質(zhì)突起均較多的多角形暗細胞，相互聚集形成腺泡、腺管樣結構；第三種為數(shù)量少、界限清晰的梭形暗細胞。傳代2天后，組織塊法培養(yǎng)的細胞數(shù)量較少，貼壁較差；酶消化法培養(yǎng)的細胞貼壁情況好，數(shù)量較多，生長情況較好。

圖1 組織塊法和酶消化法原代培養(yǎng)頜下腺細胞

圖2 組織塊法和酶消化法傳代培養(yǎng)頜下腺細胞

2.2 RSGC的鑒定結果

鏡下見細胞角蛋白-8免疫細胞化學染色呈陽性。細胞呈立方形、三角形或多邊形。細胞伸展良好，胞核藍染偏向一側，核仁1～2個，胞質(zhì)呈棕黃色，核膜及包膜清晰，部分細胞中可見深染細小顆粒狀物質(zhì)。細胞團塊中部黃染較強，周邊減弱，提示為上皮細胞來源。陰性對照組中細胞形態(tài)同上述，胞質(zhì)呈淡藍色，胞核藍染偏向一側，核仁1～2個，部分細胞中亦可見深染細小顆粒狀物質(zhì)。

圖3 DAB染色

3 討論

舍格倫綜合征、放射性涎腺炎、藥物過敏及其他自身免疫疾病等原因造成的涎腺分泌功能嚴重損害十分常見，給人們的健康帶來很大影響。20世紀80年代后期提出“組織工程”概念后，其原理和方法已廣泛應用于骨、軟骨、皮膚和肌腱等組織及器官的再造，并取得了令人矚目的成就。隨著頜下腺組織工程的發(fā)展，在再造涎腺的研究中, 對于細胞的來源及增殖能力提出要求[2,3]，如何成功培養(yǎng)頜下腺細胞變得至關重要。

大鼠頜下腺在出生時并未發(fā)育完全，頜下腺細胞在出生后繼續(xù)分化增殖[4]。Oliver等[5]成功分離、培養(yǎng)了涎腺細胞，在體外培養(yǎng)存活達 4周以上。Burford-Mason等[6]取新生乳鼠頜下腺組織進行體外培養(yǎng)，新生乳鼠細胞增殖能力強，細胞可保持較長時間的穩(wěn)定性。國內(nèi)學者劉超等[7]取1天的乳鼠，羅小寧[8]等用8天的乳鼠培養(yǎng)頜下腺細胞，均成功培養(yǎng)傳代。我們的實驗中選擇3～5天的乳鼠作為細胞取材對象。相較1天乳鼠的頜下腺過小而言，3～5天取材和去除筋膜更容易；又較8天乳鼠的細胞活性更強。

頜下腺細胞培養(yǎng)方法有組織塊法和酶消化法，組織塊法是將組織剪碎培養(yǎng)，酶消化法是利用胰蛋白酶消化細胞間質(zhì)，使頜下腺細胞分離出來。組織塊法操作簡單，但是細胞要從組織塊中游離生長，原代細胞培養(yǎng)時間相對較長。胰酶消化法可獲得大量的細胞，但過度消化細胞會給細胞帶來較大的傷害[9]。在實驗中我們對組織塊法培養(yǎng)的細胞在剪切過程中盡量剪切更細小，并向組織塊滴加1～2滴DMEM高糖無血清培養(yǎng)液，以保持濕潤以利于維持組織的活性。在鋪瓶時用眼科剪將剪切好的 20～30塊組織送入血清包被的培養(yǎng)瓶中，組織塊間距約5 mm，保證更多的生長中心，且均勻分布。在酶消化法中，保證頜下腺剪切成糊狀，并直接放于 CO2孵箱孵育，使其保持在37℃的環(huán)境中；孵育40 min，每間隔10 min震蕩一次，振蕩頻率降低，使消化更充分。離心后未完全棄掉上清，留約1 mL上清液，避免過多細胞丟失。

本實驗采用組織塊法和酶消化法兩種方法原代培養(yǎng)大鼠乳鼠頜下腺細胞。組織塊法操作簡單，用時短，成功率高，但經(jīng)該法培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，原代細胞貼壁能力差，生長周期長，且分布不均，經(jīng)過1：3傳代后，所獲細胞少，需經(jīng)較長時間才能覆蓋培養(yǎng)瓶底，難以在短期內(nèi)獲得大量頜下腺細胞。酶消化法雖操作較復雜，但貼壁情況較好，細胞數(shù)量多，分布均勻，且增殖較快。原代培養(yǎng)3天后即可傳代培養(yǎng)，經(jīng)過1：3傳代后，細胞數(shù)量依然較多，貼壁情況好，2天后細胞可覆蓋培養(yǎng)瓶底，短期內(nèi)可獲得大量頜下腺細胞。

頜下腺細胞的鑒定主要通過免疫細胞化學染色法。上皮細胞用于鑒定的抗原一般為細胞角蛋白和波形絲蛋白，腺上皮細胞對細胞角蛋白表現(xiàn)出免疫反應性，而肌上皮細胞則對波形絲蛋白表現(xiàn)免疫反應性。本實驗兩種方法培養(yǎng)出的頜下腺細胞免疫細胞化學細胞角蛋白-8染色均呈陽性表達，提示為上皮細胞來源。

頜下腺細胞體外培養(yǎng)具有重要的生物學及臨床意義。確定一種合理且高效的體外細胞分離與培養(yǎng)方法，對于涎腺疾病的研究及諸多與其相關的離體實驗，如基因轉染、藥物作用等各方面的研究有著非常重要的價值。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，酶消化法和組織塊法均可獲得3種類型的細胞，傳代后在細胞特征上也無特殊差異，但酶消化法短期內(nèi)可獲得大量頜下腺細胞。因此，酶消化法是一種較實用的培養(yǎng)大鼠乳鼠頜下腺細胞的方法。

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