杜曉濛，李 菁, 2，田向榮, 2,*，李朝陽(yáng)，李鵠鳴,2

(1. 湖南吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院， 吉首 416000； 2. 植物資源保護(hù)與利用湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 吉首 416000)

自20世紀(jì)70年代以來(lái)，以山墻蘚(Tortularuralis)等為材料的研究證實(shí)蘚類植物具有極強(qiáng)的脫水耐性[1- 3], 其典型的變水(poikilohydric)特性使它們能夠在特殊生境(如極度干旱地區(qū))和特殊基質(zhì)(如維管植物葉面)生長(zhǎng)，其特殊的生理機(jī)制使其具有極強(qiáng)的適應(yīng)干旱環(huán)境的能力[4]。而蘚類植物體內(nèi)的水分關(guān)系及耐受能力決定了其種群的分布范圍和生存能力，即濕生蘚類耐旱性較弱，干旱環(huán)境下生長(zhǎng)的蘚類具有較強(qiáng)的耐旱性。此種生理生態(tài)適應(yīng)性一方面與其棲息地水勢(shì)變化息息相關(guān)，另一方面則與生理代謝途徑的不同密不可分[5]。

然而即使長(zhǎng)期生活在同樣干旱或濕潤(rùn)環(huán)境下的不同蘚屬，其脫水耐受能力和生理生化響應(yīng)也存在一定差別。國(guó)內(nèi)對(duì)沙漠結(jié)皮蘚類，如刺葉赤蘚(SyntrichiacaninervisMitt) 和土生對(duì)齒蘚(Didymodonvinealis)的系列研究業(yè)已證明同為干旱區(qū)蘚類其耐受性存在明顯差距[6- 11]，其中對(duì)土生對(duì)齒蘚(Didymodonvinealis)與結(jié)皮共生的真蘚(Bryumargenteum)進(jìn)行光合特性分析發(fā)現(xiàn)兩種蘚類光合特性在脫水過(guò)程中差異明顯[11]。而Minibayeva和Beckett的研究也指出濕潤(rùn)環(huán)境下生長(zhǎng)的不同蘚類在產(chǎn)生氧迸發(fā)(oxidative burst)和抗氧化能力方面仍存在明顯差異[12]。

尖葉擬船葉蘚(Dolichomitriopsisdiversiformis)系船葉蘚科(Lembophyllaceae)擬船葉蘚屬植物，為東亞特有種，數(shù)量少，且分布狹窄。以往研究發(fā)現(xiàn)水分條件是限制其分布的主要因子之一[13]。由于環(huán)境日益干旱，在自然和人為因素的雙重影響下，其天然種群不斷衰減，分布范圍越來(lái)越窄，瀕臨滅絕[14]。為保護(hù)這一瀕危物種，本研究試圖以廣布濕生蘚類—濕地匐燈蘚(Plagiomniumacutum)為比較材料，從生理生態(tài)學(xué)角度探討變水下尖葉擬船葉蘚葉綠素光合熒光作用、氧代謝及其保護(hù)系統(tǒng)酶活性的變化與生態(tài)適應(yīng)的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

供實(shí)驗(yàn)的尖葉擬船葉蘚采自貴州省梵凈山海拔1680米的常葉闊葉林內(nèi)[15]，濕地匐燈蘚采自湖南省吉首市西郊德夯風(fēng)景區(qū)小溪畔，材料采集后在室溫下以自然光源作保濕培養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

選擇硅膠快速脫水法作為本實(shí)驗(yàn)脫水方式和方法[16]。以未經(jīng)處理為對(duì)比，脫水時(shí)間梯度分別為30 min(D30)、60 min(D60)、120 min(D120)、240 min(D240)；脫水不同時(shí)間后，將干燥的蘚類放置用濕濾紙覆蓋的培養(yǎng)皿中進(jìn)行復(fù)水處理，復(fù)水時(shí)間梯度為30 min(R30)、60 min(R60)、120 min(R120)、240 min(R240)。

1.2.1 含水量的測(cè)定

以干重為基礎(chǔ)計(jì)算含水量，單位為g H2O/g 干重。每個(gè)處理時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行3次重復(fù)[17]。

1.2.2 PSⅡ葉綠素?zé)晒鈪?shù)測(cè)定

用PAM- 2500便攜式調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨x和IMAGING-PAM 葉綠素?zé)晒獬上駜x(WALZ，德國(guó))分別繪制不同脫水與復(fù)水處理下的熒光光響應(yīng)曲線(ETR-PAR)和熒光成像圖，并測(cè)定最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)、光化學(xué)量子效率Y(Ⅱ)、光化學(xué)猝滅系數(shù)(qP)、非光化學(xué)猝滅系數(shù)(NPQ)等葉綠素?zé)晒鈪?shù)[18]。

1.2.3 活性氧的測(cè)定

1.2.4 抗氧化系統(tǒng)酶和非酶測(cè)定

超氧化物歧化酶(SOD)活性以抑制0.1個(gè)吸收值為1U, 過(guò)氧化氫酶(CAT)活性以每min光吸收值減少0.1為1U[21]?？箟难徇^(guò)氧化物酶(APX)以每min光吸收值減少0.1為1U[22]。抗壞血酸(AsA)含量以mg/g 干重來(lái)表示[23]。蛋白質(zhì)含量以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)[24]。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel2003和SPSS 13. 0 進(jìn)行均值、標(biāo)準(zhǔn)差和差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 脫水與復(fù)水過(guò)程中尖葉擬船葉蘚和濕地匐燈蘚含水量的變化

脫水與復(fù)水過(guò)程中兩種蘚類植物含水量變化劇烈(表1)。正常情況下，兩種蘚類的含水量均保持高水平，而D240時(shí)其含水量均迅速下降至最低值，均降至低于0.05 g H2O/g 干重以下，但D60以后含水量再無(wú)顯著差別(P>0.05)。脫水后迅速?gòu)?fù)水過(guò)程中，兩種蘚類植物的含水量均能迅速恢復(fù)，R120時(shí)基本接近對(duì)照水平，無(wú)論絕對(duì)值和變化幅度變化并無(wú)明顯差別(P>0.05)。

表1 脫水與復(fù)水過(guò)程中尖葉擬船葉蘚與濕地匐燈蘚的含水量(g H2O/g 干重)變化

同時(shí)，兩種蘚類植物含水量的差異明顯(表1)，尖葉擬船葉蘚和濕地匐燈蘚兩種蘚類的含水量分別為10.092 g H2O/g 干重和4.818 g H2O/g 干重。雖然同為濕生蘚類，但前者的含水量為后者的2.09倍。由表1還可知兩種蘚類植物的控水能力差異也較明顯。尖葉擬船葉蘚的失水和復(fù)水幅度都比濕地匐燈蘚大。脫水過(guò)程中，D120時(shí)尖葉擬船葉蘚的含水量為對(duì)照的0.70%，而濕地匐燈蘚則為其對(duì)照的1.3%，是濕地匐燈蘚的1.7倍。復(fù)水過(guò)程中，無(wú)論脫水程度如何，尖葉擬船葉蘚在R60時(shí)，含水量可恢復(fù)到其對(duì)照含水量的90%上下，而濕地匐燈蘚均須在R120后才達(dá)到其對(duì)照的90%上下，后者明顯慢于前者。

2.2 PSⅡ熒光光響應(yīng)曲線(ETR-PAR)

脫水脅迫加劇過(guò)程中，尖葉擬船葉蘚的抑制光強(qiáng)迅速降低，從對(duì)照的1375 μmol m-2s-1，下降到D30時(shí)105 μmol m-2s-1，D60時(shí)極微弱光也能造成抑制；相反，濕地匐燈蘚在D30時(shí)的抑制光強(qiáng)仍達(dá)249 μmol m-2s-1(圖1)。兩種蘚類在正常條件下所能達(dá)到的光合電子傳遞速率(ETR)都接近50μmol m-2s-1，D30時(shí)尖葉擬船葉蘚ETR僅為5 μmol m-2s-1，D60時(shí)，ETR已無(wú)法檢測(cè)；而濕地匐燈蘚D60時(shí)仍可以達(dá)到10 μmol m-2s-1(圖1)。復(fù)水后，兩種蘚類的抑制光強(qiáng)和ETR均逐漸恢復(fù)，抑制光強(qiáng)恢復(fù)迅速，R120時(shí)均可都恢復(fù)到正常水平。說(shuō)明含水量較低時(shí)PSⅡ的光電轉(zhuǎn)換能力會(huì)下降，而復(fù)水后可逐漸恢復(fù)。

圖1 脫水與復(fù)水過(guò)程中尖葉擬船葉蘚與濕地匐燈蘚的葉綠素?zé)晒夤忭憫?yīng)曲線

2.3 脫水與復(fù)水過(guò)程中尖葉擬船葉蘚和濕地匐燈蘚PSⅡ葉綠素?zé)晒鈪?shù)變化

2.3.1 Fv/Fm熒光成像整體變化

尖葉擬船葉蘚(圖2 A—F)和濕地匐燈蘚(圖2 a—f)在脫水過(guò)程中熒光逐漸暗淡，株體收縮、卷曲，從藍(lán)變綠至黃，表示Fv/Fm逐漸減小；復(fù)水過(guò)程中，葉片張開(kāi)，熒光逐漸恢復(fù)亮度，藍(lán)色面積逐漸增大，表示Fv/Fm逐漸增大。脫水過(guò)程中，尖葉擬船葉蘚Fv/Fm低于濕地匐燈蘚，R30時(shí)濕地匐燈蘚已大面積恢復(fù)藍(lán)色，而尖葉擬船葉蘚僅有局部恢復(fù)綠色，至R120時(shí)，濕地匐燈蘚已完全恢復(fù)藍(lán)色，而尖葉擬船葉蘚僅有部分區(qū)域恢復(fù)藍(lán)色，表示從整體上看尖葉擬船葉蘚在復(fù)水過(guò)程中Fv/Fm的恢復(fù)進(jìn)程明顯慢于濕地匐燈蘚。

2.3.2最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)和光化學(xué)量子效率Y(Ⅱ)

脫水與復(fù)水過(guò)程中兩種蘚類的Fv/Fm值與含水量變化的趨勢(shì)一致，呈先降后升的趨勢(shì)(圖3)。尖葉擬船葉蘚D60達(dá)到最低值0.202，較正常水平下降了68%；而復(fù)水R120時(shí)Fv/Fm值僅為0.51，仍未恢復(fù)到正常水平。濕地匐燈蘚Fv/Fm同比明顯高于尖葉擬船葉蘚。Y(Ⅱ)值的變化與Fv/Fm值的走勢(shì)相似(圖3)，其中尖葉擬船葉蘚D60時(shí)值達(dá)到最低，比對(duì)照下降了92.4%，與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)，復(fù)水至R120仍未恢復(fù)到原有水平。說(shuō)明尖葉擬船葉蘚由于PSⅡ受損，光合效能恢復(fù)較慢。

2.3.3光化學(xué)淬滅(qP)和非光化學(xué)淬滅(NPQ)

隨著脫水時(shí)間的延長(zhǎng)，尖葉擬船葉蘚的qP值迅速下降，由對(duì)照的0.658降到D60時(shí)的0.282(圖3)。其中D30與D60并無(wú)顯著差異(P>0.05)，可認(rèn)為D30時(shí)即已基本降至穩(wěn)定的低值。復(fù)水后qP迅速恢復(fù)，R30時(shí)已恢復(fù)到原有水平。濕地匐燈蘚變化幅度明顯小于尖葉擬船葉蘚。NPQ值的變化與qP值變化相反(圖3)，其中尖葉擬船葉蘚D60時(shí)NPQ最大值才0.486，為對(duì)照的2倍多。復(fù)水過(guò)程中，NPQ迅速下降，D30后與對(duì)照的水平已基本無(wú)差別(P>0.05)。而濕地匐燈蘚D60最大值達(dá)到為0.835，整個(gè)脫水和復(fù)水過(guò)程N(yùn)PQ都要高于尖葉擬船葉蘚。說(shuō)明脫水脅迫下濕地匐燈蘚可以更多地依靠熱耗散能力來(lái)保護(hù)其光合機(jī)構(gòu)，而尖葉擬船葉蘚的此種光合機(jī)構(gòu)保護(hù)能力則相對(duì)較弱。

圖2 脫水與復(fù)水過(guò)程中尖葉擬船葉蘚(A—F)與濕地匐燈蘚(a—f)Fv/Fm熒光成像整體變化

圖3 快速脫水與復(fù)水過(guò)程中尖葉擬船葉蘚與濕地匐燈蘚最大光化學(xué)效率、光化學(xué)量子效率、 光化學(xué)淬滅和 非光化學(xué)淬滅的變化

2.4 脫水與復(fù)水過(guò)程中尖葉擬船葉蘚和濕地匐燈蘚活性氧代謝的變化

2.4.1 活性氧自由基

2.4.2 抗氧化酶活性的變化

活性氧的變化誘導(dǎo)兩種蘚類的SOD、CAT、APX活性均表現(xiàn)相同走勢(shì)。其中尖葉擬船葉蘚SOD活性在D60達(dá)到最大值202.1 U/mg protein，較最初的71.2 U/mg protein上升了2.8倍；R30時(shí)活性則下降到20 U/mg protein，復(fù)水后隨時(shí)間延長(zhǎng)，SOD酶活性差異并不顯著，但低于對(duì)照原有水平(圖5)。CAT和APX活性分別在D60 min時(shí)出現(xiàn)最大值2.7 U/mg protein和3.0 U/mg protein，而復(fù)水過(guò)程中，CAT和APX雖然在R30 min時(shí)恢復(fù)到與對(duì)照無(wú)顯著差別水平(P>0.05)，但隨著復(fù)水時(shí)間延長(zhǎng)，其活性明顯下降，且尖葉擬船葉蘚始終低于濕地匐燈蘚(圖5)。說(shuō)明相對(duì)水分充沛小生境的尖葉擬船葉蘚的抗氧化酶系統(tǒng)反應(yīng)更為敏感。

2.4.3 抗壞血酸(AsA)含量

正常情況下，濕地匐燈蘚的AsA含量(2.694 mg/g 干重)比尖葉擬船葉蘚(1.189 mg/g 干重)高出50%(圖5)?？焖倜撍c復(fù)水過(guò)程中，雖然兩種蘚類AsA含量呈現(xiàn)一致變化趨勢(shì)，但尖葉擬船葉蘚的AsA含量大都低于濕地匐燈蘚近1倍。在D30時(shí)濕地匐燈蘚比對(duì)照下降了71%，而尖葉擬船葉蘚的下降幅度則不足48%；復(fù)水過(guò)程中，尖葉擬船葉蘚在R30時(shí)即已恢復(fù)到原有對(duì)照水平，而濕地匐燈蘚則到R120時(shí)才恢復(fù)到與對(duì)照一致的水平。而尖葉擬船葉蘚的AsA含量始終低于濕地匐燈蘚，說(shuō)明其由SOD歧化產(chǎn)生的多余H2O2的清除可能更多依賴于酶促系統(tǒng)。

圖4 快速脫水與復(fù)水過(guò)程中尖葉擬船葉蘚與濕地匐燈蘚超氧陰離子產(chǎn)生速率和H2O2含量的變化

圖5 快速脫水與復(fù)水過(guò)程中尖葉擬船葉蘚與濕地匐燈蘚超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶、抗壞血酸過(guò)氧化物酶活性和抗壞血酸含量的變化

3 討論與結(jié)論

3.1 含水量

蘚類植物劇烈的變溫和變水效應(yīng)說(shuō)明了其具有超強(qiáng)的脫水耐性[25]。本文的含水量實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明尖葉擬船葉蘚和濕地匐燈蘚均具備一定的耐旱能力，而脅迫下保水能力的不同是造成兩種蘚類含水量變化的主要原因[2]。根據(jù)本文結(jié)果，不難看出尖葉擬船葉蘚的正常含水量要明顯高于濕地匐燈蘚，換言之，其對(duì)環(huán)境水分的要求要高于濕地匐燈蘚。同時(shí)，在脫水與復(fù)水的變水過(guò)程中，尖葉擬船葉蘚更易失水也更易得水，說(shuō)明保水能力要明顯弱于濕地匐燈蘚。

3.2 光合熒光特性

對(duì)不同大氣溫度、蘚體含水量及光照條件下尖葉擬船葉蘚光合速率研究中，我們已發(fā)現(xiàn)光合速率與光照強(qiáng)度、大氣溫度及蘚體含水量之間關(guān)系密切，其在230

ETR反映實(shí)際光強(qiáng)條件下的表觀電子傳遞速率，以其與有效輻照(PAR)建立的熒光光響應(yīng)曲線可以很好的說(shuō)明植物光合速率及光系統(tǒng)光電轉(zhuǎn)換效率[26]。本文ETR-PAR的變化很好地說(shuō)明了尖葉擬船葉蘚PSⅡ?qū)γ撍{迫較為敏感，表現(xiàn)在脫水過(guò)程中抑制光強(qiáng)和電子傳遞速率的快速下降[27]，即使復(fù)水至R120時(shí)尖葉擬船葉蘚ETR的絕對(duì)值仍僅有對(duì)照水平50%，暗示其PSⅡ的捕光復(fù)合體修復(fù)要快于PSⅡ中心色素，即尖葉擬船葉蘚PSⅡ的反應(yīng)中心色素(P680)可能是其受脫水損傷的主要部位。

Fv/Fm和Y(Ⅱ)反映 PSⅡ反應(yīng)中心的光能轉(zhuǎn)換效率，其變化可直接體現(xiàn)植物受脅迫的情況，qP則表示光合速率快慢與光合碳同化等光合化學(xué)反應(yīng)密切相關(guān)[28]。本文中Fv/Fm，Y(Ⅱ)和qP均呈現(xiàn)在脫水時(shí)迅速下降，而在復(fù)水時(shí)漸次上升的趨勢(shì)，說(shuō)明兩種蘚類的耐脫水能力主要體現(xiàn)在復(fù)水后的修復(fù)能力[29]。與濕地匐燈蘚對(duì)比，尖葉擬船葉蘚Fv/Fm和Y(Ⅱ)在復(fù)水過(guò)程中恢復(fù)明顯較慢，相反，其qP恢復(fù)迅速和復(fù)水后的高水平則體現(xiàn)了對(duì)于光能分配中優(yōu)先光合碳同化[30]。NPQ反應(yīng)熱耗散的變化，是保護(hù)PSⅡ的重要機(jī)制，一般認(rèn)為PSⅡ熱耗散可能是通過(guò)葉黃素循環(huán)來(lái)實(shí)現(xiàn)[31]。脫水過(guò)程中NPQ的迅速升高，說(shuō)明尖葉擬船葉蘚和濕地匐燈蘚可以通過(guò)啟動(dòng)熱耗散來(lái)消耗掉過(guò)剩的光激發(fā)能，有利于其在脫水傷害中為穩(wěn)定PSⅡ[32]。而結(jié)合尖葉擬船葉蘚復(fù)水后Fv/Fm，Y(Ⅱ)的緩慢上升與qP/NPQ的比例迅速由2∶8轉(zhuǎn)換為8∶2來(lái)看，能夠說(shuō)明尖葉擬船葉蘚復(fù)水過(guò)程中NPQ值低于濕地匐燈蘚可能與其葉黃素循環(huán)效能恢復(fù)較慢有關(guān)。

3.3 活性氧代謝與抗氧化系統(tǒng)酶活性

3.4 尖葉擬船葉蘚受水分因子限制的生理生態(tài)原因

通過(guò)將尖葉擬船葉蘚與同為濕生蘚類的濕地匐燈蘚進(jìn)行光合熒光特性和抗氧化系統(tǒng)的比較，不難看出尖葉擬船葉蘚在光合機(jī)構(gòu)穩(wěn)定性和抗氧化能力上均明顯弱于濕地匐燈蘚?；诖耍馊~擬船葉蘚受到環(huán)境水分子限制的原因主要有兩個(gè) PSⅡ的反應(yīng)中心色素(P680)對(duì)脫水傷害較為敏感；復(fù)水修復(fù)過(guò)程中抗氧化保護(hù)系統(tǒng)的保護(hù)能力偏弱。換言之，尖葉擬船葉蘚耐脫水光保護(hù)機(jī)制的匱乏及其抗氧化系統(tǒng)的不完善可能是其面臨瀕危的主要生理因素?；趶V布濕生蘚類濕地匐燈蘚和尖葉擬船葉蘚兩種濕生蘚類的比較，以及與對(duì)濕度條件要求較低的金發(fā)蘚的比較[16],還可以認(rèn)為，蘚類植物對(duì)水分環(huán)境的適應(yīng)可能直接取決于光合機(jī)構(gòu)的耐受性和抗氧化系統(tǒng)能力的強(qiáng)弱。

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