李家奇，孟維艷，周延民，蔡 青，阿 蘭，付 麗，李保勝，王世振

（1.吉林大學(xué)口腔醫(yī)院種植中心，吉林 長(zhǎng)春 130021；2.山東省德州市人民醫(yī)院口腔科，山東 德州 253000）

種植義齒已成為全口或部分牙齒缺失修復(fù)的主要手段，并且有較高的成功率[1]。種植義齒的成功與否不僅取決于良好的骨結(jié)合，軟組織封閉對(duì)于種植修復(fù)的長(zhǎng)期成功率來(lái)說(shuō)也是極其重要的[2]。軟組織可形成種植體周?chē)纳飳W(xué)封閉，從而保護(hù)下面的骨組織免受微生物的侵襲。一些體外和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究[3]已證實(shí)：種植體表面的微形貌是影響成纖維細(xì)胞黏附和分化的關(guān)鍵因素。相對(duì)于光滑表面，不同的表面處理方法得到的的粗糙表面可改變上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的形態(tài)、增殖和基因表達(dá)[4]，對(duì)于提高軟組織的整合有顯著優(yōu)勢(shì)，可阻止牙齦根方遷移和細(xì)菌的入侵，從而提高軟組織穩(wěn)定性和封閉作用，減少骨吸收[5]。研究[6－7]還發(fā)現(xiàn)：與光滑表面相比，具有微米－納米表面的種植體可誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞黏附和改變膠原纖維方向，促進(jìn)牙齦組織的黏附，并且納米表面可以調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。本研究旨在通過(guò)比較光滑表面與微米－納米表面對(duì)軟組織的影響，尋找出一種可促進(jìn)牙齦軟組織附著的純鈦表面形貌，并為今后種植體頸部設(shè)計(jì)提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試件的制備

圓柱形純鈦試件（D 3mm×11mm，萊頓北京生物材料制品公司提供）40個(gè)，使用砂紙（耐水砂紙600目、耐水砂紙320目、不耐水砂紙320目、不耐水砂紙160目）依次對(duì)鈦柱表面進(jìn)行打磨，再使用不同溶液（丙酮、無(wú)水乙醇和蒸餾水）對(duì)鈦件依次沖洗10min。試件隨機(jī)分成4組，每組10個(gè)。光滑組（S組）：不做任何處理；酸蝕組（AE組）：用一定濃度（1∶199）氫氟酸對(duì)鈦柱軸面進(jìn)行2min酸蝕處理；電化學(xué)腐蝕組（ECE組）：用自制電解儀對(duì)鈦柱軸面進(jìn)行直流電化學(xué)處理，采用不同濃度（0.1～17.0mol·L－1）氫氟酸得到2種不同表面，分別為ECE1和ECE2組；電化學(xué)腐蝕加酸蝕組（ECA組）：在ECE2組處理的基礎(chǔ)上再用一定濃度（1∶199）氫氟酸對(duì)鈦柱軸面進(jìn)行2min酸蝕處理。處理過(guò)的種植體再經(jīng)上述3種溶液依次超聲清洗10min，高溫（121.3℃）、高壓（1.05kg·cm－2）20min滅菌后備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康成年雜種犬（吉林大學(xué)和平小區(qū)動(dòng)物醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心提供）6只，雌、雄各半，體質(zhì)量12～14kg。

1.3 方 法

犬以速眠新注射液（吉林大學(xué)和平校區(qū)動(dòng)物醫(yī)院提供）肌肉注射（0.1mL·kg－1），麻醉成功后，口腔消毒，口外鋪巾，局部黏骨膜下注射2%利多卡因。采用微創(chuàng)拔牙器械拔除犬右側(cè)下頜第一和第二前磨牙、左側(cè)第一前磨牙。甲硝唑和生理鹽水反復(fù)沖洗拔牙創(chuàng)，采用即刻種植＋非埋植種植術(shù)，用組合鉆（鉆速＜1 500r·min－1）逐級(jí)備孔，按預(yù)定順序植入5枚種植體（即S組、AE組、ECE1組、ECE2組和ECA組各1顆），頂端高于黏膜3mm，扭力達(dá)到30N。種植體均無(wú)咬合接觸，緊密縫合牙齦。術(shù)后每天肌注青霉素80萬(wàn)U，連用5d。每天用1%洗必泰液擦洗口腔1次，連擦7d。各組犬均予軟飼料喂養(yǎng)?？p合線任由脫落。種植術(shù)后20d時(shí)處死3只，3個(gè)月時(shí)處死3只。

1.4 掃描電鏡標(biāo)本制備

用鋸條取下含種植體的下頜骨塊，用片鋸修建成1cm×1cm×1cm骨、牙齦和種植體聯(lián)合標(biāo)本，以0.1mol·L－1磷酸緩沖液沖洗，固定于3%戊二醛2d。用Leica SP1600鋸式切片機(jī)從種植體中心位置沿縱軸切割，取一半標(biāo)本以0.1mol·L－1磷酸緩沖液沖洗15min，0.5%鋨酸固定1h，再以0.1mol·L－1磷酸緩沖液15min，50%、70%、80%、90%和95%酒精逐級(jí)脫水各15min。真空干燥法干燥，噴金，掃描電鏡（SEM）觀察牙齦與種植體結(jié)合界面，然后再機(jī)械拉除軟組織，觀察種植體表面和軟組織黏附于種植體的組織面。

2 結(jié) 果

2.1 種植體表面掃描電鏡觀察

S組低倍鏡下（×180）觀察種植體表面較光滑（圖1A）；高倍鏡下（×20 000）見(jiàn)較淺的溝紋（圖1B）。AE組低倍鏡下（×500）觀察種植體表面微粗糙（圖1C）；高倍鏡下（×50 000）可見(jiàn)均勻密集的納米突，為20～100nm的圓鈍突起（圖1D）。ECE1組低倍鏡下（×40）見(jiàn)種植體表面粗糙，并可見(jiàn)均勻的凹孔（圖1E）；高倍鏡下（×500）見(jiàn)直徑約30～80μm圓形或橢圓形淺碟狀凹（圖1F），10 000倍鏡下見(jiàn)凹的表面呈蜂窩狀，邊緣不規(guī)則（圖1G）。ECE2組低倍鏡下（×200）見(jiàn)均勻細(xì)膩的微粗糙種植體表面（圖1H）；高倍鏡下（×500）見(jiàn)分布均勻的微米凹，該微米凹為圓形或橢圓形淺碟狀凹，凹內(nèi)含有散在的小孔（圖1I）；2 000倍鏡下可見(jiàn)微米凹的直徑約10～25μm（圖1J）。ECA組低倍鏡下（×50）可見(jiàn)種植體表面均勻細(xì)膩，微粗糙形態(tài)（圖1K）；200倍鏡下見(jiàn)分布均勻的微米－納米表面，該表面的微米凹為圓形或橢圓形淺碟狀凹，直徑約10～25μm，邊緣圓鈍，表面可見(jiàn)白色粒狀物質(zhì)形成，即納米突（圖1L）；該納米突在40 000倍鏡下可見(jiàn)均勻分布于微米凹的表面，呈直徑約20～80nm的半球形突起（圖1M）。

圖1 各組種植體表面掃描電鏡圖Fig.1 SEM pictures of implant surface in various groups

2.2 種植體及種植體周?chē)浗M織觀察

本組共有2只種植體松動(dòng)，分別于術(shù)后3和5d時(shí)脫落。余下種植體周?chē)例l無(wú)紅腫，軟組織為粉紅色，較致密。種植體無(wú)松動(dòng)，種植體周?chē)猩倭寇浌浮?個(gè)月時(shí)周?chē)例l粉紅致密，無(wú)紅腫，緊密包繞種植體周?chē)７N植體無(wú)松動(dòng)，周?chē)猩倭寇浌浮?/p>

2.3 牙齦掃描電鏡觀察

2.3.1 種植體－上皮組織界面 掃描電鏡下觀察，各組犬牙齦上皮斷面呈層狀，表面角化層明顯，20d時(shí)結(jié)合上皮與種植體表面連接緊密，各組間比較未見(jiàn)明顯差異（圖2）；3個(gè)月時(shí)，上皮組織更加致密，上皮組織緊密附著在種植體表面，各組間未見(jiàn)明顯差異，但其厚度明顯大于生長(zhǎng)20d時(shí)（圖3）。

2.3.2 種植體－結(jié)締組織界面 20d時(shí)，S組結(jié)締組織與種植體大部分開(kāi)裂分離，膠原纖維伸向種植體表面時(shí)與種植體表面平行排列（圖4A）；AE組也可見(jiàn)結(jié)締組織與種植體部分開(kāi)裂，膠原纖維呈樹(shù)枝狀，膠原纖維根部與種植體表面緊密垂直接觸（圖4B）；ECE1組結(jié)締組織開(kāi)裂較少，膠原纖維比酸蝕組濃密，膠原纖維垂直緊密附著在種植體表面，呈簇狀（圖4C）；ECE2組結(jié)締組織開(kāi)裂也較少，膠原纖維方向比較雜亂，呈網(wǎng)狀垂直扎向種植體表面（圖4D）；ECA組膠原纖維比較濃密，比AE組稍致密，呈綹狀垂直扎向種植體表面（圖4E）。3個(gè)月時(shí)，S組結(jié)締組織和種植體大部分開(kāi)裂分離，膠原纖維致密排列，與種植體表面平行（圖4F）；AE組膠原纖維排列較濃密，膠原纖維垂直扎向種植體表面（圖4G）；ECE1組膠原纖維非常濃密，膠原纖維互相交錯(cuò)垂直扎向種植體表面，可見(jiàn)部分不規(guī)律斜行纖維（圖4H）；ECE2組少量結(jié)締組織與種植體分離，膠原纖維緊密排列呈綹狀，垂直扎向種植體（圖4I）；ECA組膠原纖維比較濃密，膠原纖維互相交錯(cuò)，垂直扎向種植體表面，可見(jiàn)不規(guī)律的斜行纖維（圖4J）。生長(zhǎng)3個(gè)月的結(jié)締組織高度大于生長(zhǎng)20d的結(jié)締組織。

圖2 20d時(shí)上皮組織與種植體表面結(jié)合部位掃描電鏡圖Fig.2 SEM pictures of conjunction of epithelium and implant surface at 20th day

圖3 3個(gè)月時(shí)上皮組織與種植體表面結(jié)合部位掃描電鏡圖Fig.3 SEM pictures of conjunction of epithelium and implant surface at 3rd month

圖4 20d和3個(gè)月時(shí)結(jié)締組織和種植體表面結(jié)合部位掃描電鏡圖Fig.4 SEM pictures of conjunction of collagen fibers and implant surface at 20th day and 3rd month

2.3.3 種植體表面 20d和3個(gè)月時(shí)掃描電鏡下 觀察種植體表面均未見(jiàn)明顯的上皮組織殘留物。20d時(shí)，S組種植體表面較干凈，見(jiàn)少量的膜狀物和極少量膠原纖維殘留，表面暴露大部分金屬紋理（圖5A和B）。AE組低倍鏡下見(jiàn)表面殘留膠原纖維量比光滑組多，呈斑片狀；高倍鏡下見(jiàn)膠原纖維與種植體表面垂直黏附（圖5C和D）。ECE1組低倍鏡下見(jiàn)種植體表面大部分被殘留的膠原纖維覆蓋；高倍鏡下見(jiàn)斷裂的膠原纖維垂直扎在種植體表面，部分膠原纖維平行于種植體（圖5E和F）。ECE2組低倍鏡下見(jiàn)種植體表面大部分被無(wú)定形基質(zhì)和膠原纖維覆蓋；高倍鏡下見(jiàn)部分無(wú)定形基質(zhì)與表面分離翹起，成簇的膠原纖維垂直扎向種植體表面（圖5G和H）。ECA組低倍鏡下見(jiàn)膠原纖維黏附于種植體表面呈簇狀；高倍鏡下見(jiàn)膠原纖維垂直黏附于種植體表面，部分無(wú)定形基質(zhì)與表面分離翹起（圖5I和J）。3個(gè)月時(shí)，S組低倍鏡下觀察種植體表面殘留少量膜狀物和膠原纖維，表面大部分暴露金屬紋理，高倍鏡下見(jiàn)殘留的膜狀物分離翹起，膠原纖維平行黏附在表面（圖6A和B）。AE組表面殘留的膜狀物和膠原纖維比S組多，低倍鏡下呈魚(yú)鱗狀，殘留的膠原纖維厚實(shí)；高倍鏡下發(fā)現(xiàn)膠原纖維垂直表面，其下面的無(wú)定形基質(zhì)大部分與種植體表面分離（圖6C和D）。ECE1組低倍鏡下見(jiàn)表面凹孔中殘留大量的膜狀物和膠原纖維；高倍鏡下見(jiàn)膠原纖維有水平平鋪于種植體表面，也可見(jiàn)有垂直伸向種植體表面（圖6E和F）。ECE2組低倍鏡下見(jiàn)表面殘留大量的膠原纖維，呈斑塊狀非常厚實(shí)；高倍鏡下見(jiàn)膠原纖維伸出2～3個(gè)突起扎在凹孔中（圖6G和H）。ECA組低倍鏡下見(jiàn)殘留大量的膠原纖維和膜狀物，呈龜裂的斑塊狀；高倍鏡下見(jiàn)膠原纖維垂直伸向種植體表面，像觸角一樣的突起緊緊抓在凹孔壁的納米突上（圖6I～K）。

圖5 20d時(shí)去除軟組織后種植體表面掃描電鏡圖Fig.5 SEM pictures of implant surface after removing soft tissue at 20th day

圖6 3個(gè)月時(shí)去除軟組織后種植體表面掃描電鏡圖Fig.6 SEM pictures of implant surface after removing soft tissue at 3rd month

2.3.4 與種植體表面黏附的軟組織界面 20d和3個(gè)月時(shí)與種植體表面黏附的牙齦組織面無(wú)顯著差別。S組與種植體黏附的牙齦組織面為光滑的一層無(wú)定形基質(zhì)膜狀結(jié)構(gòu)（圖7A）。AE組與種植體黏附的牙齦組織面見(jiàn)與種植體表面納米突大小相對(duì)應(yīng)的納米凹（圖7B）。ECE1組與種植體黏附的牙齦組織面見(jiàn)與種植體微米凹大小相對(duì)應(yīng)且相對(duì)粗糙的微米突（圖7C）。ECE2組與種植體黏附的牙齦組織面見(jiàn)與種植體表面微米凹大小相對(duì)應(yīng)的光滑突起，該突起頭大帶蒂鑲嵌在種植體表面（圖7D）。ECA組與種植體黏附的牙齦組織面見(jiàn)與種植體微米－納米結(jié)構(gòu)大小相對(duì)應(yīng)的微米突，該突起表面有大量納米凹，與種植體表面形成錯(cuò)綜復(fù)雜的微米－納米鑲嵌結(jié)構(gòu)（圖7E）。

圖7 牙齦軟組織與種植體結(jié)合部位的組織面掃描電鏡圖Fig.7 SEM pictures of tissue surfaces of gingival conjuncted with implant surface

3 討 論

種植修復(fù)是否成功與骨和軟組織對(duì)種植體表面的緊密附著有關(guān)，除了骨，軟組織黏附于種植體頸部的封閉作用也是非常重要的[8]。種植體通過(guò)不同表面改性方法得到的不同粗糙表面可對(duì)成纖維細(xì)胞和膠原纖維產(chǎn)生較大影響[9]。近年來(lái)，對(duì)粗化種植體頸部表面形貌，尤其是微米形貌和納米形貌的作用越來(lái)越受到關(guān)注[10]。

本組動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中有2只種植體可能因進(jìn)食或咬硬物等不確定因素導(dǎo)致脫落，其余種植體均與周?chē)M織結(jié)合良好。本研究觀察到：S組膠原纖維平行黏附于種植體表面，結(jié)締組織與種植體界面之間見(jiàn)較多大小不等的裂隙，撕脫軟組織后的種植體表面殘留的膠原纖維非常少，可見(jiàn)結(jié)締組織與光滑表面種植體的黏附力是較低的。本研究結(jié)果表明：改變種植體頸部的表面形貌是提高軟組織黏附的關(guān)鍵因素，尤其是多空三維的微米－納米形貌，可誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞呈錨狀緊密扎在種植體表面空隙中，使結(jié)締組織緊密附著，改善軟組織黏附力[11]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)電化學(xué)方法得到的具有微米凹的ECE2表面，膠原纖維垂直扎入微米凹中，開(kāi)裂現(xiàn)象少見(jiàn)；結(jié)締組織與種植體結(jié)合的組織面形成頭大帶蒂的突起，該突起鑲嵌在種植體表面微米凹中，在撕脫軟組織這種強(qiáng)大的外力下，膠原纖維即使自身斷裂，而膠原纖維根方像觸手一樣緊緊抓在微米凹壁上，特別是結(jié)締組織生長(zhǎng)3個(gè)月時(shí)的種植體表面，幾乎全部被殘留的膠原纖維覆蓋，足以看出這種微米表面與結(jié)締組織的黏附是很牢固的；ECA組結(jié)締組織未見(jiàn)與種植體表面開(kāi)裂，結(jié)締組織組織面與種植體表面也形成了錯(cuò)綜復(fù)雜的微米－納米鑲嵌結(jié)構(gòu)，膠原纖維根方像觸手一樣垂直抓在微米凹和納米突上，有的一根膠原纖維甚至分出2～3個(gè)分支抓在納米突上，生長(zhǎng)20d和3個(gè)月的種植體表面，均大部分被殘留的膠原纖維覆蓋，表明微米－納米表面與結(jié)締組織的黏附也非常緊密。Zhao等[12]研究發(fā)現(xiàn)：種植體表面大小適宜的空洞可以誘導(dǎo)結(jié)締組織膠原纖維垂直插入種植體表面，形成緊密結(jié)合，表明以上的微米表面和微米－納米表面均可促進(jìn)結(jié)締組織緊密附著，ECA組兼具的納米表面更有優(yōu)勢(shì)。本研究中，AE組也可見(jiàn)結(jié)締組織與種植體表面開(kāi)裂，垂直伸向種植體表面的膠原纖維只能抓在納米突上，結(jié)締組織組織面與種植體表面的納米級(jí)突起黏附，撕脫軟組織后的種植體表面殘留的膠原纖維不多，表明結(jié)締組織與種植體黏附力不及ECE2組和ECA組，但優(yōu)于S組；ECE1組種植體表面的微米凹為30～80μm，比ECE2組和ECA組的凹孔大，可見(jiàn)其表面有一部分膠原纖維平行黏附在種植體表面，而其他各實(shí)驗(yàn)組均未見(jiàn)任何平行黏附的纖維。有研究[13]發(fā)現(xiàn)：膠原纖維平行排列的結(jié)締組織易向根方遷移，而垂直黏附的膠原纖維與種植體表面結(jié)合緊密，可防止其軟組織退縮。本研究中，ECE1組種植體表面殘留的膠原纖維較S組和AE組多，可推斷該表面結(jié)締組織的黏附力相對(duì)ECE2組和ECA組較弱，但優(yōu)于AE組和S組。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Rossi等[14]研究結(jié)果相一致，與光滑種植體表面相比，粗糙多孔的微米－納米種植體表面確實(shí)與上皮組織和結(jié)締組織結(jié)合較緊密，軟組織不易脫離，炎癥反應(yīng)輕且骨組織吸收少。本研究結(jié)果提示：種植體周?chē)例l上皮和結(jié)締組織的附著與種植體頸部的表面形貌密切相關(guān)，微米和微米－納米 表面可促進(jìn)結(jié)締組織牢固附著，明顯改善牙齦組織與種植體頸部的黏附，從而阻止結(jié)合上皮的根方移動(dòng)，防止細(xì)菌及產(chǎn)物進(jìn)入骨組織內(nèi)，為種植的成功奠定基礎(chǔ)。目前種植體表面影響軟組織附著的微形貌大小形態(tài)研究結(jié)果不一，最適軟組織黏附的精準(zhǔn)表面和具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步探討。

本研究雖發(fā)現(xiàn)上皮組織呈層狀黏附于種植體頸部，但將種植體與牙齦撕脫后，種植體表面未見(jiàn)任何殘留的上皮結(jié)構(gòu)，可見(jiàn)上皮與種植體表面的黏附是非常脆弱的。本研究中，除S組外，結(jié)締組織膠原纖維均垂直呈網(wǎng)狀緊密黏附在種植體表面，撕脫牙齦后的種植體表面可見(jiàn)膠原纖維殘留，這與Nevins等[15]研究結(jié)果一致，說(shuō)明牙齦組織主要是依靠結(jié)締組織黏附在種植體頸部，上皮組織的黏附作用非常微弱，結(jié)締組織是封閉口腔環(huán)境和種植體－骨組織界面的重要結(jié)構(gòu)。本研究結(jié)果顯示：生長(zhǎng)3個(gè)月時(shí)牙齦上皮和結(jié)締組織厚度均明顯大于生長(zhǎng)20d的上皮和結(jié)締組織，可見(jiàn)軟組織生長(zhǎng)成熟需要較長(zhǎng)時(shí)間；同時(shí)發(fā)現(xiàn)：膠原纖維近種植體表面的一端埋在種植體表面的一層無(wú)定形物質(zhì)中，厚約20nm，將種植體表面與膠原纖維分隔開(kāi)，特別是ECE2組和ECA組，撕脫掉軟組織后的種植體表面幾乎看不到金屬表面，只見(jiàn)與種植體表面形貌起伏相當(dāng)?shù)臒o(wú)定形膜狀結(jié)構(gòu)和殘留的膠原纖維，結(jié)締組織似乎是黏附在種植體表面，這種黏附可能有阻擋結(jié)合上皮根方遷移的作用。

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