張曉春，鄭曉敏，陳 誠，李義德

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院兒科，寧夏 銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，寧夏 銀川 750004）

同種造血干細(xì)胞移植（allogeneic stem cell transplantation，allo-SCT）后，移植物抗白血病效應(yīng)（graft versus ceukemia，GVL）由細(xì)胞毒性T細(xì)胞（cytotoxic T-lymphocyte，CTL）和自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞所介導(dǎo)[1]，是白血病患者得以治愈的關(guān)鍵反應(yīng)。近年來研究[2]表明：腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）在NK細(xì)胞和CTL細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫中發(fā)揮極其重要的作用。t（17；19）-急性淋巴細(xì) 胞 白 血 ?。╝cute lymphoblastic leukemia，ALL）預(yù)后極差，來源于t（17；19）（q21-q22；p13）的致癌基因E2A-HLF阻斷內(nèi)源性凋亡通路，在白血病形成及化療藥物耐受中起關(guān)鍵作用[3]。（17；19）-ALL患者多于診斷后2年內(nèi)復(fù)發(fā)，但allo-SCT可 改 善 其 預(yù) 后[4]。 國 內(nèi) 外 已 有 相 關(guān) 研究[5－7]表 明：重 組 人 可 溶 性 TRAIL（rhsTRAIL）對(duì)乳腺癌、惡性膠質(zhì)瘤和肺癌等具有抗腫瘤效應(yīng)，但rhsTRAIL對(duì)t（17；19）-ALL作用的研究尚少。本研究擬通過t（17；19）-ALL細(xì)胞株對(duì)rhsTRAIL的敏感性初步分析其可能作用機(jī)制，探討其臨床意義，為臨床治療t（17；19）-ALL提供新思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株、主要試劑和儀器 t（17；19）-ALL細(xì)胞株4株（Endo-kun、HAL-O1、UOC-B1和 YCU-B2），混合譜系白血?。∕LL）ALL（MLL＋-ALL）細(xì)胞株9株（KOPN1、KOPB26、KOCL33、KOCL 44、KOCL 45、KOCL 50、KOCL 51、KOCL 58和 KOCL 69），Ph1＋-ALL細(xì) 胞 株 6 株（KOPN30bi、KOPN 57bi、KOPN 66bi、KOPN 72bi、YAMN73 和 YAMN 91），前B ALL細(xì)胞株13株，包括t（1；19）細(xì)胞 株 7 株（697、 KOPN34、 KOPN 36、KOPN 60、KOPN 63、YAMN90和YAMN 92）、t（ 12；21）細(xì)胞株1株（Reh）及其他細(xì)胞株5株（KOPN35、KOPN 61、KOPN 62、KOPN 79和KOPN 84），以上細(xì)胞株均來自日本山梨大學(xué)醫(yī)學(xué)部小兒科。細(xì)胞株用含10%FCS的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2、飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。1例t（17；19）-ALL患者的骨髓經(jīng)Ficoll-Hypaque密度梯度離心分離出單核細(xì)胞（原始細(xì)胞＞95%），RPMI 1640培養(yǎng)液離心洗滌，懸于含10%FCS的RPMI 1640培養(yǎng)液中?；颊邩?biāo)本的使用經(jīng)寧夏醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。Annexin-V-FITC、藻紅蛋白（PE）標(biāo)記的抗生物素蛋白鏈菌素、Caspase廣 譜 抑 制 劑z-VAD-fmk和 rhsTRAIL（Killer TRAIL）分別購自BestBio、Invitrogen、Sigma和Alexis公司。死亡受體4（DR4）、死亡受體5（DR5）、誘騙受體1（DcR1）及誘騙受體 2（DcR2）單克隆抗體購自美國Accurate公司，鼠抗人PARP、caspase-3為美國BD公司產(chǎn)品，鼠抗人caspase-8單抗、tubulin和兔抗人Bid抗體為日本MBL公司產(chǎn)品。

1.2 TRAIL受體在細(xì)胞表面的表達(dá) 取細(xì)胞懸液，加入1μg生物素標(biāo)記的鼠IgG1或者DR4、

DR5、DcR1及DcR2的單克隆抗體，冰上孵育30min；加入PE標(biāo)記的抗生物素蛋白鏈菌素，冰上孵育30min后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。相對(duì)熒光強(qiáng)度（RFI）＝特異染色的平均熒光強(qiáng)度/對(duì)照染色的平均熒光強(qiáng)度。以RFI代表受體表達(dá)水平。

1.33H標(biāo)記的胸腺嘧啶（3H-thymidine）法檢測(cè)rhsTRAIL對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用 調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0×109L－1，接種于經(jīng)紫外線消毒的96孔平底培養(yǎng)板中，每孔 100μL（終濃度 0.5×108L－1），每組設(shè)3個(gè)平行樣。添加3倍稀釋的rhsTRAIL（最終濃度分別為11、33和100μg·L－1），按指定方法孵育36h，在培養(yǎng)的最后6h內(nèi)給予脈沖（每孔1μCi），隨即收集至玻璃纖維濾器；不添加孔作為對(duì)照組。用液體閃爍計(jì)數(shù)器計(jì)算整合入DNA的放射活性。rhsTRAIL的阻斷率＝（1－處理孔每分鐘記數(shù)次數(shù)/未處理孔每分鐘記數(shù)次數(shù)）×100%。t（17；19）-ALL細(xì)胞株添加rhsTRAIL（100μg·L－1），加入TRAIL中和抗體 RIK-2（10g·L－1）或caspase抑制劑z-VAD-fmk（20mmol·L－1）培養(yǎng)42h，在最后6h按上述方法檢測(cè)3H-thymidine吸收；不添加者作為對(duì)照組。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 取細(xì)胞懸液，接種于經(jīng)紫外線消毒的24孔板，每孔1mL（終濃度 1×108L－1）。TRAIL 孔 加 入 rhsTRAIL 100μg·L－1，對(duì)照孔加入新鮮培養(yǎng)液，12h后收集細(xì)胞。FITC標(biāo)記的Annexin-V染色，采用流式細(xì)胞儀（BD，F(xiàn)ACSCalibur）檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡率。

1.5 免疫印跡法檢測(cè)caspase-8、Bia、caspase-3和PARP表達(dá) 取細(xì)胞懸液，接種于經(jīng)紫外線消毒的24孔板，每孔1mL（終濃度1×105L－1）。TRAIL孔加入rhsTRAIL 100μg·L－1，對(duì)照孔加入新鮮培養(yǎng)液，24h后收集細(xì)胞，用NP液制備細(xì)胞裂解液并進(jìn)行蛋白定量。經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜后，5%TBS脫脂奶封閉，加入鼠抗人caspase-8、Bid、caspase-3和PARP，4℃孵育過夜。PBS洗滌3次后加入二抗振蕩反應(yīng)1h。TBST洗3次，TBS洗1次。ECL放射自顯影，掃描圖像保存。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。細(xì)胞增殖抑制率、細(xì)胞凋亡率和TRAIL受體表達(dá)水平以中位數(shù)及95%可信區(qū)間（95%CI）表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 各組ALL細(xì)胞株TRAIL受體表達(dá) 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)TRAIL受體DR4、DR5、DcR1和DcR2在細(xì)胞表面的表達(dá)。t（17；19）-ALL細(xì)胞株表面DR4和DR5均為陽性表達(dá)，而DcR1和DcR2呈陰性表達(dá)。t（17；19）-ALL細(xì)胞株DR4表達(dá)水平（RFI）為1.91，明顯高于 MLL＋-ALL、Ph1＋-ALL和其他前 B-ALL 細(xì)胞株（均P＜0.05）；DR5表達(dá)水平明顯高于 MLL＋-ALL細(xì)胞株（P＜0.05）。見表1。

表1 TRAIL受體在ALL細(xì)胞株表面的表達(dá)水平Tab.1 Expression levels of TRAIL receptors on surface of ALL cell lines [M（95%CI）]

2.2 各組ALL細(xì)胞株的增殖抑制率 不同濃度的rhsTRAIL均能夠抑制t（17；19）-ALL細(xì)胞株的增殖（圖1A），且隨著rhsTRAIL濃度增加抑制作用增強(qiáng)，rhsTRAIL濃度為100μg·L－1時(shí)，4株細(xì)胞增殖完全被抑制。這種抑制作用在添加TRAIL中和抗體RIK2或caspase抑制劑z-VAD-fmk后被阻斷（圖1B），提示rhsTRAIL對(duì)t（17；19）-ALL細(xì)胞株增殖的抑制作用為TRAIL特異性，并依賴于caspase。添加rhsTRAIL培養(yǎng)后，t（17；19）-ALL、MLL＋-ALL、Ph1＋-ALL和其他前B-ALL細(xì)胞株的細(xì)胞增殖抑制 率 分 別 是 100.00%、4.95%、49.56% 和24.63%，4株t（17；19）-ALL細(xì)胞株增殖抑制率顯著高于9株 MLL＋-ALL細(xì)胞株（P＜0.01）、6株P(guān)h1＋-ALL細(xì)胞株（P＜0.05）和13株其他前B-ALL細(xì)胞株（P＜0.05）。

2.3 各組 ALL細(xì)胞株凋亡率及caspase-8、Bid、caspase-3和PARP的表達(dá) rhsTRAIL處理4株t（17；19）-ALL細(xì)胞株后，細(xì)胞早期凋亡明顯（圖2），其凋亡率分別由未處理時(shí)的9%、19%、10%和8%上升為85%、97%、98%和91%，而相同條件下，對(duì)rhsTRAIL耐受的MLL＋-ALL細(xì)胞株KOPN30bi凋亡率僅由6%上升至7%。rhsTRAIL處理后，t（17；19）-ALL細(xì)胞早期凋亡率與KOPN30bi細(xì)胞株比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。免疫印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示：在rhsTRAIL作用2h內(nèi)，caspase-8、Bid、caspase-3和PARP的活化條帶出現(xiàn)，并隨時(shí)間推移逐漸強(qiáng)化。見圖3。

2.4 t（17；19）-ALL原代細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果 患者白血病細(xì)胞的DR4和DR5表達(dá)水平（RFI）與t（17；19）-ALL細(xì)胞株相似；添加rhsTRAIL培養(yǎng)后，細(xì)胞增殖受到抑制，并發(fā)生早期凋亡。?

圖1 不同濃度rhsTRAIL作用下t（17；19）-ALL細(xì)胞株的增殖抑制率（A）及特異性（B）Fig.1 Inhibitory rates of proliferation of t（17；19）-ALL cell lines（A）after treated with different rhsTRAIL and its sensitivity（B）

圖2 rhsTRAIL對(duì)t（17；19）-ALL細(xì)胞株早期凋亡的誘導(dǎo)作用Fig.2 Induction of rhsTRAIL in apoptosis in t（17；19）-ALL cell lines

3 討 論

腫瘤的免疫監(jiān)視受到固有免疫和適應(yīng)性細(xì)胞免疫的調(diào)控，其中主要包括CTL和NK細(xì)胞，其表達(dá)的TRAIL在抗腫瘤免疫中發(fā)揮著極其重要的作用[8－9]。目 前 發(fā) 現(xiàn) 的 TRAIL 受 體 中，DR4（TRAIL-R1）和DR5（TRAIL-R2）與 TRAIL結(jié)合后，將死亡信息傳遞至細(xì)胞內(nèi)，激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)系統(tǒng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[10]。DcRl（TRAIL-R3）和 DcR2（TRAIL-R4）競(jìng) 爭(zhēng) DR4 和 DR5 與TRAIL的結(jié)合[11]。

圖3 rhsTRAIL對(duì)t（17；19）-ALL細(xì)胞株凋亡通路的激活作用Fig.3 Activation of rhsTRAIL in apoptosis pathway in t（17；19）-ALL cell lines

正常細(xì)胞中，誘騙受體（DcR）表達(dá)占優(yōu)勢(shì)，腫瘤細(xì)胞由于缺乏DcR的保護(hù)而易被TRAIL殺傷，因此TRAIL有別于其他TNF家族成員TNF和FasL的高毒性，能選擇性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，而對(duì)正常細(xì)胞幾乎無毒性[12－13]，這一特性使其在腫瘤治療上有廣泛的應(yīng)用前景，成為近年來腫瘤治療研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。國內(nèi)外前期臨床試驗(yàn)[5－7]結(jié)果顯示：重組TRAIL蛋白對(duì)乳腺癌、惡性膠質(zhì)瘤和肺癌等具有抗腫瘤效應(yīng)，其抗腫瘤譜廣，療效明顯。

t（17；19）（q21-q22；p13）是一種較罕見的易位，形成融合基因E2A-HLF，見于不足1%的ALL患兒[3]。伴有該基因的ALL以B前體細(xì)胞表型、高血鈣癥和獲得性凝血異常為特點(diǎn)[4]。近年來隨著化療方案的進(jìn)步，兒童及青少年ALL長(zhǎng)期預(yù)后得到顯著改善，但t（17；19）-ALL治療效果仍極差，有報(bào)道該類患兒5年死亡率高達(dá)66%～100%。國外14例化療的個(gè)案報(bào)道中，13例t（17；19）-ALL患兒在診斷2年內(nèi)復(fù)發(fā) [第1次完全緩解（CR）中位數(shù)為9個(gè)月]，僅1例第1次CR期（診斷后13周）進(jìn)行了同種骨髓移植的患兒維持CR至42個(gè)月[4]，表明早期進(jìn)行allo-SCT有助于延長(zhǎng)患兒無病生存時(shí)間。因此，為探討allo-SCT對(duì)改善t（17；19）-ALL預(yù)后的臨床意義，有必要明確t（17；19）-ALL細(xì)胞是否對(duì)TRAIL敏感，從而最終對(duì)GVL效果敏感。

本研究結(jié)果顯示：rhsTRAIL處理t（17；19）-ALL細(xì)胞后，細(xì)胞早期凋亡率明顯高于對(duì)照細(xì)胞株，細(xì)胞增殖受到顯著抑制，與對(duì)照細(xì)胞株比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這種抑制作用在添加TRAIL中和抗體RIK2或caspase廣譜抑制劑z-VAD后被阻斷，提示t（17；19）-ALL細(xì)胞株對(duì)rhsTRAIL的敏感性為TRAIL特異性并依賴于caspase的活性。本研究發(fā)現(xiàn)：t（17；19）-ALL細(xì)胞株表面DR4和DR5表達(dá)均為陽性，且其表達(dá)水平明顯高于其他前B-ALL細(xì)胞株，提示t（17；19）-ALL細(xì)胞株對(duì)rhsTRAIL高度敏感，其細(xì)胞表面DR4和DR5的高表達(dá)發(fā)揮了重要作用。

TRAIL與其死亡受體（DR）結(jié)合后，形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物，促使procaspase-8在局部募集并自我裂解形成有活性的凋亡起始蛋白caspase-8，后者切斷procaspase-3，激活外源性凋亡通路[14]，同時(shí)催化Bcl-2家族蛋白Bid斷裂，激活內(nèi)源性凋亡通路[15]。由于雙重促凋亡途徑的激活，TRAIL可有效誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示：rhsTRAIL處理t（17；19）-ALL細(xì)胞株后2h內(nèi)，caspase-8、caspase-3、Bid和PARP均發(fā)生不同程度活化，且活化作用隨時(shí)間推移而增強(qiáng)，提示內(nèi)源性、外源性凋亡通路均受到激活是t（17；19）-ALL細(xì)胞株對(duì)rhsTRAIL高度敏感的另一個(gè)重要原因。

綜上所述，因細(xì)胞表面高表達(dá)DR4、DR5以及內(nèi)源性和外源性凋亡通路的激活，t（17；19）-ALL細(xì)胞對(duì)TRAL誘導(dǎo)的細(xì)胞毒作用敏感。t（17；19）-ALL對(duì)化療反應(yīng)不佳，臨床應(yīng)盡早進(jìn)行allo-SCT，從而改善其預(yù)后。融合基因E2A-HLF對(duì)t（17；19）-ALL細(xì)胞 TRAIL死亡受體的作用及其機(jī)制將是下一步的研究重點(diǎn)。

[1]Kolb HJ，Schmid C， Barrett AJ，et al. Graft-versusleukemia reactions in allogeneic chimeras [J].Blood，2004，103（3）：767-776.

[2]Rezvani K， Barrett AJ. Characterizing and optimizing immune responses to leukemia antigens after allogeneic stem cell transplantation [J].Best Pract Res Clin Haematol，2008，21（3）：437-453.

[3]Seidel MG， Look AT. E2A-HLF usurps control of evolutionarily conserved survival pathways [J].Oncogene，2001，20（40）：5718-5725.

[4]Inukai T，Hirose K，Inaba T，et al.Hypercalcemia in childhood acute lymphoblastic leukemia：frequent implication of parathyroid hormone-related peptide and E2A-HLF from translocation 17；19 [J].Leukemia，2007，21（2）：288-296.

[5]Rahman M，Pumphrey JG，Lipkowitz S.The TRAIL to targeted therapy of breast cancer [J].Adv Cancer Res，2009，103（1）：43-73.

[6]Gaiser T，Becker MR，Habel A，et a1.TRAIL-mediated apoptosis in malignant glioma cells is augmented by celecoxib through proteasomal degradation of survivin [J].Neurosci Lett，2008，442（2）：109-113.

[7]Stegehuis JH，de Wilt LH，de Vries EG，et al.TRAIL receptor targeting therapies for non-small cell lung cancer：current status and perspectives [J].Drug Resist Updat，2010，13（1）：2-15.

[8]Wiley SR，Schooley K，Smolak PJ，et al.Identification and characterization of a new member of the TNF family that induces apoptosis [J].Immunity，1995，3（6）：673-682.

[9]Shand JC，Jansson J，Hsu YC，et al.Differential gene expression in acute lymphoblastic leukemia cells surviving allogeneic transplant [J].Cancer Immunol Immunother，2010，59（11）：1633-1644.

[10]Sheridan JP，Marsters SA，Pitti RM，et al.Control of TRAIL-induced apoptosis by a family of signaling and decoy receptors[J].Science，1997，277（5327）：818-821.

[11]Ashkenazi A，Dixit VM.Apoptosis control by death and decoy receptors [J].Curr Opin Cell Biol，1999，11（2）：255-260.

[12]Rosario Y，Carmen P， Abelardo LR.The therapeutic potential of TRAIL receptor signalling in cancer cells [J].Clin Transl Oncol，2011，13（12）：839-847.

[13]Wilson NS，Dixit V，Ashkenazi A.Death receptor signal transducers：nodes of coordination in immune signaling networks [J].Nature Immunol，2009，10（4）：348-355.

[14]Crowder RN，El-Deiry WS.Caspase-8regulation of TRAIL-mediated cell death [J].Exp Oncol，2012，34（3）：160-164.

[15]Matthews GM，Newbold A，Johnstone RW.Intrinsic and extrinsic apoptotic pathway signaling as determinants of histone deacetylase inhibitor antitumor activity [J].Adv Cancer Res，2012，116（3）：165-197.