佟 瑤，張毛毛，李 麗，殷德輝，曲笑鋒，齊燕飛，李 娟，徐 坤（.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生檢驗(yàn)教研室，吉林 長(zhǎng)春 300；.東北師范大學(xué)化學(xué)系 多酸科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 3004）

甲型H1N1流感病毒宿主范圍廣，容易發(fā)生抗原漂移和抗原變異，常引發(fā)世界范圍的大流行[1]，其所致的急性呼吸道傳染病人群普遍易感，導(dǎo)致全球范圍18 000人死亡[2]。接種疫苗是預(yù)防和控制甲型流感最經(jīng)濟(jì)有效的措施，但是一些人在接種疫苗后出現(xiàn)不同程度的不良反應(yīng)[3]，由于血凝素（HA）抗原不斷發(fā)生變異，人體內(nèi)產(chǎn)生的抗體并不能持續(xù)有效預(yù)防甲型流感。甲型流感病毒主要通過(guò)呼吸道飛沫和接觸途徑傳播，良好的個(gè)人衛(wèi)生習(xí)慣和經(jīng)常洗手是預(yù)防該疾病的有效方法[4]。澳大利亞和美國(guó)的學(xué)者分別在2009年和2012年，使用美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)方法研究其國(guó)內(nèi)手部消毒產(chǎn)品的抗病毒效果，結(jié)果顯示這些產(chǎn)品能有效清除手部流感病毒[5－6]，預(yù)防疾病發(fā)生。國(guó)內(nèi)尚未見類似產(chǎn)品及其效果方面研究，因而研制具有抗甲型H1N1流感病毒作用的洗手液對(duì)預(yù)防控制甲型流感流行具有十分重要的意義。多酸化合物是一類前過(guò)渡金屬氧陰離子簇，這類物質(zhì)在體內(nèi)外表現(xiàn)出對(duì)RNA病毒、DNA病毒的良好抑制作用，且毒性低[7－11]，但在生物體內(nèi)應(yīng)用的效果不理想，體表應(yīng)用也許是發(fā)展方向。本文作者設(shè)計(jì)合成了一種以多酸為有效成分的洗手液，并對(duì)其抗甲型H1N1流感病毒效果和安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)，以期為開發(fā)具有抗甲型H1N1流感病毒作用的洗手液奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣 品

多酸化合物K10Na [（VO）3（SbW9O33）2]·26H2O（PM-1001）和 K15[Pr（BW11O39）2]·28H2O（Pr-B）由東北師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院和吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院按照相關(guān)文獻(xiàn)[12－13]合成。含多酸成分的新型洗手液由吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院合成。

1.2 細(xì)胞株與病毒株

MDCK細(xì)胞株和甲型H1N1流感病毒（A/XD/01/2009）由解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康昆明小鼠20只，雌雄各半，體質(zhì)量（20±2）g，購(gòu)自吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。健康白色家兔3只，1～2月齡，體質(zhì)量（2.0±0.2）kg，購(gòu)自吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.4 多酸化合物體外抗病毒活性

在長(zhǎng)滿單層MDCK細(xì)胞的96孔板中加入用DMEM培養(yǎng)液分別稀釋的2種多酸化合物，劑量分 別 是 5 000.000、2 500.000、1 250.000、625.000、312.500、156.250和78.125mg·L－1，對(duì)照組僅加入培養(yǎng)液，每組4復(fù)孔。在37℃、5%CO2飽和濕度條件的溫箱中培養(yǎng)48h后，采用MTT法測(cè)定細(xì)胞存活量，計(jì)算最大無(wú)毒濃度（TC0）、半數(shù)中毒濃度（TC50）和90%中毒濃度（TC90）。

96孔板中的MDCK細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后，棄掉其中液體，分為3組。①正常細(xì)胞對(duì)照組：僅加入DMEM培養(yǎng)液；②病毒對(duì)照組：加入含100倍組織培養(yǎng)半數(shù)感染劑量（TCID50）濃度病毒的培養(yǎng)液；③實(shí)驗(yàn)組：分別將PM-1001和Pr-B從TC0濃度開始2倍稀釋為8個(gè)濃度，加入100TCID50濃度病毒感染的MDCK細(xì)胞中，每組4復(fù)孔。培養(yǎng)板在37℃、5%CO2和飽和濕度條件的溫箱中培養(yǎng)，連續(xù)觀察，48h后采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活量，計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50）和治療指數(shù)（TI）。TI＝ TC50/IC50）。

1.5 含多酸新型洗手液抗甲型流感病毒效果評(píng)價(jià)

選擇10名志愿者，簽署書面知情同意書，隨機(jī)分為2組，在試驗(yàn)過(guò)程中手部皮膚無(wú)破損，試驗(yàn)前1周手部不使用任何含有抗菌劑成分的物質(zhì)。試驗(yàn)前，志愿者用普通洗手液，按照六步洗手法洗手15s，用無(wú)菌紗布擦干，在手心加75%酒精1.5mL，反復(fù)摩擦整個(gè)手部至酒精晾干。用凍存管在指腹上按壓一個(gè)約為8mm的范圍，在其中涂抹107.5TCID50/0.1mL（含5%胎牛血清，作為有機(jī)干擾物）的病毒懸液0.02mL，晾干。每名志愿者的10個(gè)手指隨機(jī)分為5對(duì)，其中1對(duì)手指加病毒液后立即用0.4mL培養(yǎng)液洗脫病毒，1對(duì)手指為對(duì)照組，病毒液晾干后直接用0.4mL培養(yǎng)液回收，剩余3對(duì)手指為實(shí)驗(yàn)組，分別依次接觸0.4mL含高、中、低濃度多酸的洗手液和0.4mL標(biāo)準(zhǔn)硬水，然后用0.4mL培養(yǎng)液洗脫病毒。以上各種液體均加入到2mL凍存管中，管口按照按壓痕跡接觸涂抹病毒液的區(qū)域。以上操作均在生物安全柜中進(jìn)行。使用MCDK細(xì)胞檢測(cè)洗脫液中病毒的TCID50，與對(duì)照組比較，計(jì)算洗手液實(shí)際減少的病毒量。實(shí)際減少的病毒量＝log10TCID50（對(duì)照組）－log10TCID50（實(shí)驗(yàn)組）。

1.6 甲型流感病毒在人手部存活能力檢測(cè)

選擇2名志愿者，簽署書面知情同意，準(zhǔn)備工作與1.5相同。志愿者的10個(gè)手指隨機(jī)分為5對(duì)，其中1對(duì)為對(duì)照組，病毒液晾干后直接用0.4mL培養(yǎng)液回收；2對(duì)手指在病毒液晾干30min后，使用0.4mL培養(yǎng)液回收；2對(duì)手指在病毒液晾干60min后，使用0.4mL培養(yǎng)液回收。使用MCDK細(xì)胞檢測(cè)洗脫液中病毒的TCID50，與對(duì)照組比較，計(jì)算洗手液實(shí)際減少的病毒量，計(jì)算方法同1.5。

1.7 含多酸成分的新型洗手液安全性評(píng)價(jià)

1.7.1 小鼠急性經(jīng)口毒性實(shí)驗(yàn) 昆明小鼠20只，雌雄各半，動(dòng)物室適應(yīng)性飼養(yǎng)7d，無(wú)異常。灌胃前禁食過(guò)夜，不限制飲水，按照5 000mg·kg－1體質(zhì)量給予洗手液（濃度約1.25g·mL－1）。給藥后連續(xù)觀察14d，每天記錄體質(zhì)量和一般狀態(tài)，第14天處死小鼠，解剖后觀察骨骼及臟器是否異常。

1.7.2 家兔完整皮膚刺激實(shí)驗(yàn) 家兔3只，動(dòng)物室適應(yīng)性飼養(yǎng)7d，無(wú)異常。試驗(yàn)前24h用脫毛機(jī)將家兔背部脊柱兩側(cè)的毛去掉，面積為3cm×3cm。取0.5mL洗手液涂抹于面積為2.5cm×2.5cm的一側(cè)去毛完整皮膚上，蓋保鮮膜，用醫(yī)用膠布固定，2h后用溫水除去殘留洗手液。另一側(cè)皮膚作為空白對(duì)照。分別于去除洗手液后1、24和48h觀察皮膚局部反應(yīng)，記錄結(jié)果。按 《消毒技術(shù)規(guī)范》（2008版）中的方法計(jì)算刺激指數(shù)。

1.7.3 家兔急性眼刺激實(shí)驗(yàn) 吸取0.1mL洗手液滴入家兔一側(cè)眼結(jié)膜囊內(nèi)，另一側(cè)以生理鹽水作為正常對(duì)照。將眼被動(dòng)閉合4s，30s后用生理鹽水沖洗。于滴眼后1h、24h、48h、72h、7d、14d和21d觀察家兔眼結(jié)膜、虹膜和角膜的損傷與恢復(fù)情況。按 《消毒技術(shù)規(guī)范》（2008版）中的方法計(jì)算眼刺激評(píng)分。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。各組洗脫液中病毒濃度以10x±sTCID50/0.1mL 表示，對(duì)log10TCID50進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，病毒濃度組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，對(duì)照組、30min回收病毒組和60min回收病毒組間病毒濃度比較采用方差分析和SNK法。

2 結(jié) 果

2.1 多酸化合物體外抗病毒活性研究

2種多酸化合物PM-1001和Pr-B體外抗甲型H1N1流感病毒的TI分別是82.68和69.13，結(jié)果見表1。按2種化合物TC0、（TC0＋EC50）/2和EC50濃度配制成高、中、低劑量洗手液。

2.2 含多酸新型洗手液抗甲型H1N1流感病毒的效果評(píng)價(jià)

接觸手指后直接回收的病毒濃度平均為104.33±0.66TCID50/0.1mL，對(duì)照組病毒濃度平均為104.29±0.41TCID50/0.1mL，使用 含 2 種 多 酸 的 高、中、低劑量洗手液后，細(xì)胞培養(yǎng)法均未檢測(cè)出病毒殘留，各洗手液組病毒濃度與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），各洗手液組間病毒濃度比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。含2種多酸不同劑量的洗手液均具有良好的清除人手部甲型流感病毒的活性，各洗手液效果比較無(wú)明顯差異。見表2。

表1 2種多酸化合物對(duì)MDCK細(xì)胞毒性和抗病毒效果Tab.1 Toxicities and anti-viral effects of two compounds on MDCK cells against H1N1

表2 含2種多酸洗手液對(duì)甲型流感病毒的抑制效果Tab.2 Efficacies of two hand-washing agents against H1N1 influenza virus （n＝5）

2.3 甲型流感病毒在人手部存活能力檢測(cè)

對(duì)照組病毒濃度對(duì)數(shù)平均數(shù)為104.29±0.40TCID50/0.1mL，晾干后30和60min回收病毒的濃度對(duì)數(shù)平均數(shù)分別為103.98±0.42TCID50/0.1mL和103.83±0.35TCID50/0.1mL，各組病毒濃度比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），病毒在手部60min存活能力無(wú)明顯變化。見表3。

表3 甲型流感病毒在人手部30和60min存活能力Tab.3 Survival abilities of H1N1influenza virus on human hands for 30and 60min （n＝4）

2.4 含多酸成分新型洗手液的安全性評(píng)價(jià)

選擇含有高劑量PM-1001的洗手液進(jìn)行毒性實(shí)驗(yàn)。①小鼠急性經(jīng)口毒性實(shí)驗(yàn)：灌胃給予洗手液后，小鼠狀態(tài)未見異常，14d內(nèi)無(wú)死亡，第14天處死小鼠，解剖觀察骨骼及臟器均未見異常。含有高劑量PI-1001的洗手液小鼠經(jīng)口毒性的半數(shù)致死濃度（LD50）＞5 000mg·kg－1（體質(zhì)量），屬實(shí)際無(wú)毒級(jí)物質(zhì)。②家兔完整皮膚刺激實(shí)驗(yàn)：洗手液可以使家兔皮膚出現(xiàn)勉強(qiáng)可見的紅斑，無(wú)水腫現(xiàn)象，皮膚刺激指數(shù)最高為0.33，出現(xiàn)在去掉洗手液1h時(shí)，然后逐漸恢復(fù)，2h內(nèi)可完全恢復(fù)。含有高劑量PM-1001的洗手液皮膚刺激指數(shù)小于0.5，屬于無(wú)刺激性洗手液。③家兔急性眼刺激實(shí)驗(yàn)：加入洗手液時(shí)，家兔無(wú)刺激反應(yīng)。洗手液可使家兔出現(xiàn)結(jié)膜充血和結(jié)膜輕微水腫，72h內(nèi)完全恢復(fù)，對(duì)3只家兔眼刺激的平均評(píng)分分別為0、0.67和0.33。含有高劑量PM-1001的洗手液對(duì)家兔眼造成的損傷是可逆性，屬無(wú)刺激性物質(zhì)。

3 討 論

本研究結(jié)果顯示：甲型H1N1流感病毒在人手部 60min后滴度為 103.83±0.35TCID50/0.1mL，與對(duì)照組比較無(wú)顯著差異，表明病毒在自然條件下，可以在手部存活60min以上，手可能成為攜帶病毒和傳播病毒的媒介；使用洗手液后，細(xì)胞培養(yǎng)法未檢測(cè)到病毒，說(shuō)明手部此時(shí)已無(wú)活病毒存在或者活病毒量極低，證明洗手液可以有效除去手部的病毒，阻斷流感病毒通過(guò)手部接觸的傳播。本研究結(jié)果顯示：該洗手液配方溫和，對(duì)動(dòng)物皮膚和眼部均無(wú)刺激，對(duì)家兔進(jìn)行刺激實(shí)驗(yàn)時(shí)，家兔無(wú)明顯的掙扎抵抗，對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃后，小鼠未出現(xiàn)不良反應(yīng)，體質(zhì)量增加無(wú)異常，這與同類研究[14－15]得到的結(jié)論一致。其中加入的有效成分PM-1001在體外實(shí)驗(yàn)中，對(duì)登革熱病毒、呼吸道合胞病毒、單純皰疹病毒Ⅰ型、免疫缺陷病毒和副流感病毒等均表現(xiàn)出良好的抗病毒作用[16]。根據(jù)本研究結(jié)果推斷：將PM-1001加入洗護(hù)產(chǎn)品中，可能對(duì)上述病毒均具有良好的作用效果。這種將多酸化合物應(yīng)用在體表的方法，避免了多酸應(yīng)用于體內(nèi)的諸多不確定因素和安全問(wèn)題，可以更簡(jiǎn)單有效地發(fā)揮出多酸卓越的抗病毒特性。本研究初步探索了多酸與外用洗液聯(lián)合作用的抗病毒效果，為進(jìn)一步研制含有多酸化合物的外用洗液、藥物等提供了依據(jù)。

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