康 婷，黃世友，李 鵬，史 婷，余 擎，段銀鐘

(1.第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院正畸科軍事口腔醫(yī)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西西安710032;2.解放軍第422醫(yī)院，廣東湛江524005;3.成都軍區(qū)機(jī)關(guān)醫(yī)院，四川成都610000;4.河南護(hù)理職業(yè)學(xué)院，河南安陽455000)

當(dāng)活細(xì)胞和有機(jī)體受到環(huán)境中的機(jī)械刺激時(shí)，機(jī)械信號隨即被轉(zhuǎn)化成生物信號，并將其整合使之表現(xiàn)為細(xì)胞反應(yīng)，這一現(xiàn)象稱為機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)［1］。機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)與一大類細(xì)胞膜分子相關(guān)，主要包括離子通道、特異性細(xì)胞骨架蛋白、細(xì)胞連接分子、G蛋白耦合受體和激酶等［2-3］。在最近的研究中，學(xué)者們多傾向于將離子通道作為一種具有傳導(dǎo)性的分子，并已確定了最有可能的分子種類。目前認(rèn)為，機(jī)械敏感性通道(Mechanosensitive channel，MSCs)或稱為機(jī)械門控性通道(Mechano-gated channel)，是活細(xì)胞表面的機(jī)械刺激轉(zhuǎn)化為細(xì)胞內(nèi)電信號或化學(xué)信號時(shí)主要的機(jī)械感受器，并與細(xì)胞骨架一起構(gòu)成機(jī)械感受器體系［4-6］。壓電離子通道(Piezo)是最近發(fā)現(xiàn)的一種新型機(jī)械敏感離子通道，2010年Coste等采用RNA干擾技術(shù)通過降低Neuro2A細(xì)胞的機(jī)械反應(yīng)，確定了其基因序列，并結(jié)合全細(xì)胞刺激/記錄的膜片鉗和分子生物學(xué)的方法對其進(jìn)行了驗(yàn)證［7］。目前，關(guān)于Piezo的特性和功能還有很多重要方面尚未明確。

牙周膜(又稱牙周韌帶)由致密的結(jié)締組織構(gòu)成，其成分主要有纖維、基質(zhì)、牙骨質(zhì)小體和細(xì)胞(成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、成牙骨質(zhì)細(xì)胞以及少量干細(xì)胞)，并且有血管、神經(jīng)、淋巴管分布。牙周膜作為連接牙齒和牙槽窩的組織，不僅可以緩沖咀嚼壓力，還可承受各種正畸力，是正畸矯治的重要生物學(xué)基礎(chǔ)［8-10］。Piezos是與機(jī)械反應(yīng)有關(guān)的基因產(chǎn)物，因其具有機(jī)械敏感性而可被機(jī)械力直接激活［11］，并參與細(xì)胞對傷害性刺激的反應(yīng)［12］、細(xì)胞數(shù)量的自我平衡［13］以及細(xì)胞容積的調(diào)控［14］，在多種細(xì)胞和組織上均有其表達(dá);但目前尚沒有研究證明Piezos蛋白在牙周組織中的表達(dá)及相關(guān)功能。本實(shí)驗(yàn)擬通過間接免疫熒光技術(shù)，在蛋白水平觀察壓電離子通道Piezos蛋白在牙周組織的表達(dá)，以了解其定位特點(diǎn)，并結(jié)合有關(guān)Piezos離子通道生理特性的研究基礎(chǔ)，初步探討Piezos蛋白在牙周組織機(jī)械感受中的作用。

1 材料和方法

1.1 主要材料、試劑和儀器

雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供);170 g/L EDTA脫礦液(上海Sangon生物工程技術(shù)公司);0.01 mol/L檸檬酸鹽抗原修復(fù)液(自配，檸檬酸0.4 g、檸檬酸鈉2.4 g，溶于1 000 mL三蒸水中，調(diào)節(jié)pH至6.0左右);Piezo1和Piezo2兔抗大鼠多克隆抗體(Abcam，英國);Alexa Fluor? 488標(biāo)記山羊抗小鼠IgG熒光二抗(北京中衫金橋生物技術(shù)公司);生物組織自動(dòng)脫水機(jī)(TS-12U)、生物組織包埋機(jī)(BMIX)、攤片烤片機(jī)(CS-VI)(孝感宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司);石蠟切片機(jī)(RM 2235，Leica公司，德國);激光共聚焦顯微鏡(FV-1000，Olympus公司，日本)。

1.2 方法

1.2.1 牙周組織標(biāo)本制備和切片

取8周齡雄性SD大鼠(體質(zhì)量200 g左右，牙列完整，無畸形及齲損)，用戊巴比妥過量麻醉處死后，取雙側(cè)上頜包含后牙及其周圍牙槽骨的骨塊，置新鮮配制的40 g/L多聚甲醛液中固定24 h(4℃)。然后將固定后的各組織塊分別置50 mL 170 g/L EDTA液中進(jìn)行脫鈣，每3 d更換1次脫鈣液。待針刺標(biāo)本可以輕松穿透時(shí)(約2個(gè)月)，取出標(biāo)本流水沖洗24 h(充分去除殘留EDTA)，并分別用600、700、800、950 mL/L(2 份次)乙醇脫水各12 h;正丁醇浸泡12 h后再分別放入無水乙醇(3份次)中脫水各12 h、1∶1乙醚/無水乙醇1 h、氯仿(3份次)各30 min;最后在57℃下浸蠟3 h。取上述處理后的各標(biāo)本，分別用慢速打磨機(jī)進(jìn)行修整，以便控制切片方向;然后常規(guī)石蠟包埋，并沿牙齒矢狀向作連續(xù)切片(片厚3 μm)、49℃展片、陽離子防脫載玻片撈片，60℃烤片2～3 h后用于免疫組化檢測。

1.2.2 間接免疫熒光檢測

上述組織切片常規(guī)脫蠟至水，并分別置于0.01 mol/L檸檬酸鹽抗原修復(fù)液中，微波加熱修復(fù)抗原后，滴加山羊血清封閉30 min(室溫);滴加5 μg/mL的 Piezo1抗體和 Piezo2抗體(一抗)，4 ℃孵育過夜;PBS搖洗 10 min×3次，滴加 Alexa Fluor? 488標(biāo)記的山羊抗小鼠 IgG熒光二抗(1∶50稀釋)，37℃孵育1 h;PBS搖洗10 min×3次，滴加2 μg/mL的 DAPI，30℃孵育30 min進(jìn)行襯染;最后滴加防淬滅封片劑封片，并置于激光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行觀察。分別在每張組織切片上確定上頜第一磨牙根中1/3部位的牙周膜后，從中隨機(jī)選擇5個(gè)視野，使用ImagePro Plus測定其灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Piezo1和Piezo2的表達(dá)量比較用隨機(jī)設(shè)計(jì)t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

Piezo1和Piezo2在牙周成纖維細(xì)胞中均呈陽性表達(dá)，其中Piezo2的表達(dá)量低于Piezo1，其灰度值分別為281.9±32.4和115.5±42.2，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。但Piezo1和Piezo2兩種蛋白在不同部位牙周膜里的表達(dá)分布并不均勻(熒光強(qiáng)弱不一致)，在根側(cè)牙周膜成纖維細(xì)胞中Piezos的表達(dá)沿牙周主纖維的走形呈斜行分布;在靠近固有牙槽骨處的牙周膜中的成骨細(xì)胞上也有少量表達(dá)，而且在這些細(xì)胞中的表達(dá)部位集中于胞膜上，部分在胞漿里;但在固有牙槽骨中的骨細(xì)胞中未見有Piezos蛋白的特異性陽性表達(dá)，只在牙槽骨的孔隙中有團(tuán)狀的陽性表達(dá)(圖1～2)。

圖1 Piezo1在牙周組織中的表達(dá)

圖2 Piezo2在牙周組織中的表達(dá)

3 討論

牙周膜中有大量縱橫交錯(cuò)的膠原纖維束，其間布滿細(xì)胞和組織液，而這些血液來源的組織液充滿了牙周膜的所有空腔。牙周膜之所以能在復(fù)雜的咀嚼運(yùn)動(dòng)中有效地發(fā)揮減震器的功能，正是因?yàn)榫邆淞诉@種多液體、多孔、富有彈性的網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，而其形態(tài)的維持依賴于咬合力對牙周組織的刺激［15］。體內(nèi)研究證明，牙周膜內(nèi)的基質(zhì)細(xì)胞，特別是成纖維細(xì)胞和成骨細(xì)胞均具有獲得機(jī)械信號的效應(yīng)器，不但能夠感受機(jī)械力，還可產(chǎn)生一系列維持牙周膜寬度和保護(hù)細(xì)胞的多樣性的反應(yīng)［16］。牙周膜和牙槽骨的細(xì)胞特征表明，當(dāng)咀嚼力作用于牙齒時(shí)，可由牙周膜來完成牙槽骨的快速改建［17-18］。因此，咀嚼力下的牙周膜機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)決定了牙槽骨骨量和牙周膜形態(tài)的維持［19］。機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)與離子通道、特異性細(xì)胞骨架蛋白等有密不可分的關(guān)系，而Piezos離子通道則是一類具有傳導(dǎo)性的分子，并因其能快反應(yīng)而成為效率很高的壓力感受器［20］;但牙周膜成纖維細(xì)胞是否也表達(dá)該通道蛋白，目前尚未見相關(guān)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)通過間接免疫熒光標(biāo)記觀察發(fā)現(xiàn)，Piezo1和Piezo2蛋白在牙周膜中均呈陽性表達(dá)，其中Piezo1的表達(dá)量明顯高于Piezo2，與Coste等［7］報(bào)道的Piezo2比Pierol表達(dá)水平更低的結(jié)果類似。雖然不能排除其他離子通道在牙周膜感受機(jī)械力時(shí)的作用，但由于Piezos離子通道具有完整的機(jī)械敏感性［7］，仍然可以推測該通道在牙周膜中可能具有獨(dú)立的機(jī)械敏感感知功能;并且可能存在與其他離子通道不同的激活模式。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，固有牙槽骨中的成熟骨細(xì)胞未見Piezos的表達(dá)，而在牙周膜成纖維細(xì)胞中有大量表達(dá)。由此可以推測，在非外力移動(dòng)牙齒的狀態(tài)下，牙周膜中的成纖維細(xì)胞伴隨牙周膜主纖維生長，處在感受咀嚼力的前沿，連同位于固有牙槽骨表面的成骨細(xì)胞一起，可能都是活躍的Piezos離子通道表達(dá)細(xì)胞。雖然細(xì)胞感知咀嚼力引起的形變、壓力和受力的分子機(jī)制仍不夠清楚，但是根據(jù)該離子通道的表達(dá)情況，至少可以推測其參與了牙周膜感知的功能。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了牙周組織，特別是牙周膜中有豐富的機(jī)械敏感性離子通道 Piezos的表達(dá)，其中Piezo2的表達(dá)量明顯低于Piezo1。鑒于牙周膜是牙周組織中對牙齒受到的機(jī)械力刺激進(jìn)行感受的第一效應(yīng)器，而Piezos作為一個(gè)在其他組織中已被證實(shí)與細(xì)胞機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)及傷害性感受有關(guān)的機(jī)械敏感離子通道，可能在其中扮演了感受器的角色。該發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步研究牙周組織對于咀嚼力、正畸力的分子生物學(xué)反應(yīng)奠定了一定的基礎(chǔ)。

［1］Huang H，Kamm RD，Lee RT.Cell mechanics and mechanotransduction:pathways，probes，and physiology［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2004，287(1):C1-C11.

［2］Matthews BD，Thodeti CK，Tytell JD，et al.Ultra-rapid activation of TRPV4 ion channels by mechanical forces applied to cell surface beta1 integrins［J］.Integr Biol，2010，2(9):435-442.

［3］Anishkin A，Kung C.Stiffened lipid platforms at molecular force foci［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2013，110(13):4886-4892.

［4］Gillespie PG，Walker RG.Molecular basis of mechanosensory transduction［J］.Nature，2001，413(6852):194-202.

［5］Hamill OP，Martinac B.Molecular basis of mechanotransduction in living cells［J］.Physiol Rev，2001，81(2):685-740.

［6］Chalfie M.Neurosensory mechanotransduction［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2009，10(1):44-52.

［7］Coste B，Mathur J，Schmidt M，et al.Piezo1 and Piezo2 are essential components of distinct mechanically activated cation channels［J］.Science，2010，330(6000):55-60.

［8］Cho MI，Garant PR.Development and general structure of the periodontium［J］.Periodontol，2000，2000，24(1):9-27.

［9］Henneman S，Von den Hoff JW，Maltha JC.Mechanobiology of tooth moverment［J］.Eur J Orthod，2008，30(3):299-306.

［10］Krishnan V，Davidovitch Z.On a path to unfolding the biological mechanisms of orthodontic tooth movement［J］.J Dent Res，2009，88(7):597-608.

［11］Martinac B.The ion channels to cytoskeleton connection as potential mechanism of mechanosensitivity［J］.Biochimi Biophys Acta，2014，1838(2):682-691.

［12］Dubin AE，Schmidt M，Mathur J，et al.Inflammatory signals enhance piezo2-mediated mechanosensitive currents［J］.Cell Rep，2012，2(3):511-517.

［13］Fernandez-Gonzalez R，Zallen JA.Feeling the squeeze:livecell extrusion limits cell density in epithelia［J］.Cell，2012，149(5):965-967.

［14］Gottlieb PA，Bae C，Gnanasambandam R，et al.Piezo1 mutations identified in xerocytosis alter the inactivation rate［J］.Biophys J，2013，104(2，S1):467a-467a.

［15］李晶，洪巖松，鐘鳴，等.咬合力喪失影響大鼠牙周組織中iNOS mRNA的表達(dá)［J］.現(xiàn)代口腔醫(yī)學(xué)雜志，2006，20(4):394-396.

［16］Wise GE，King GJ.Mechanisms of tooth eruption and orthodontic tooth movement［J］.J Dent Res，2008，87(5):414-434.

［17］Toms SR，Lemons JE，Bartolucci AA，et al.Nonlinear stressstrain behavior of periodontal ligament under orthodontic loading［J］.Am J Orthod Dentofacial Orthop，2002，122(2):174-179.

［18］Krishnan V，Davidovitch Z.Cellular，molecular，and tissuelevel reactions to orthodontic force［J］.Am J Orthod Dentofacial Orthop，2006，129(4):469.e1-469.e32.

［19］McCulloch CA，Lekic P，McKee MD.Role of physical forces in regulating the form and function of the periodontal ligament［J］.Periodontol，2000，2000，24(1):56-72.

［20］Ross TD，Coon BG，Yun S，et al.Integrins in mechanotransduction［J］.Curr Opin Cell Biol，2013，25(5):613-618.