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(鄭州輕工業(yè)學院食品與生物工程學院，河南鄭州 450002)

凍藏時間對麥谷蛋白和麥醇溶蛋白二級結構及面團性能的影響研究

李學紅，胡鐘毓，陸勇，荊曉燕，劉延奇

(鄭州輕工業(yè)學院食品與生物工程學院，河南鄭州 450002)

分別對小麥醇溶蛋白和麥谷蛋白在-18℃下凍藏0～28d后其巰基和二硫鍵含量以及二級結構的變化情況進行研究，并分析了變化可能的內在機理；進一步探討了凍藏導致的面團質構變化與兩種面筋蛋白結構變化的對應關系。結果表明：凍藏處理使麥醇溶蛋白和麥谷蛋白中巰基含量增加、二硫鍵含量減少，α-螺旋和β-轉角結構含量下降，β-折疊結構含量升高；其中，凍藏處理對麥谷蛋白二級結構的影響程度要明顯大于麥醇溶蛋白。質構研究結果表明：兩種蛋白質中二硫鍵、α-螺旋和β-轉角結構含量的減少，對凍藏后面團粘性、彈性、硬度的降低有著重要影響。

麥谷蛋白，麥醇溶蛋白，結構，凍藏，質構

隨著冷凍面團技術應用的日益廣泛，對其的研究也越發(fā)深入，但到目前為止，仍有一些問題沒有得到很好解決。例如速凍和凍藏處理導致的面團品質下降就是其中之一。研究已經表明，面團烘焙制品的感官品質與凍藏處理后面團的面筋蛋白結構變化有關[1]，凍藏使自由水結晶，從而破壞面筋網絡結構，使烘焙面制品質量下降。而麥谷蛋白和麥醇溶蛋白是面筋蛋白的主要組成部分，面筋蛋白的結構變化也由這兩種蛋白結構變化決定。所以小麥醇溶蛋白和麥谷蛋白對面筋網絡結構和冷凍面團的質量有著重要影響。Yuthana Phimolsiripol、劉國琴等人研究低溫對面團、面筋蛋白分子結構的影響[2-3]，但凍藏對面筋蛋白的重要組成部分——麥醇溶蛋白和麥谷蛋白的結構影響卻鮮見報道。本文就凍藏時間對小麥醇溶蛋白和麥谷蛋白二級結構的影響進行了研究，分析了凍藏處理后這兩種蛋白質二級結構變化以及可能的內在機理，并將之與同樣冷凍處理后的面團質構性能的變化相印證，從而得出凍藏導致的麥谷蛋白和麥醇溶蛋白結構的變化對面團品質的影響，為提高冷凍面團品質提供理論參考。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

甘氨酸、Tris、EDTA、濃鹽酸、5,5，-二硫代-2-硝基苯甲酸(DTNB)、脲、鹽酸胍、三氯乙酸 分析純；面粉 鄭州金苑面粉有限公司，特一粉。

雙波長紫外可見分光光度計 上海奧譜勒儀器有限公司；磁力攪拌器 江蘇中大儀器廠；真空干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司；旋轉蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；高速離心機 北京醫(yī)用離心機廠；IR7650型傅里葉紅外光譜儀 上海分析儀器廠；TA-XTplus物性測試儀 Stable Micro System；凝膠過濾層析柱 上?？等A生化儀器制造廠；BSZ-100自動部份收集器 上海滬西分析儀器廠；紫外檢測儀 上海滬西儀器廠。

1.2實驗方法

1.2.1 樣品處理 取500g的面粉，加水洗去淀粉成為濕面筋蛋白備用(含水量約為50%)。

取部分上述濕面筋(不隔絕空氣)在27℃，-100kPa下真空常溫干燥18h后得面筋蛋白粉，再從中提取出麥醇溶蛋白和麥谷蛋白進行巰基和二硫鍵的測定以及紅外光譜分析。

取余下濕面筋(不隔絕空氣)先在-40℃下速凍40min，然后在-18℃下凍藏7～28d，然后在27℃，-100kPa下真空常溫干燥18h后得面筋蛋白粉，再提取兩種蛋白質分別進行巰基和二硫鍵的測定以及紅外光譜的分析。

1.2.2 麥醇溶蛋白和麥谷蛋白的提取及純度分析 取一定量的面筋蛋白粉按1∶35(m/v)的比例加入72%的乙醇，充分混勻后磁力攪拌2h，然后在4000r/min條件下離心20min。提取上清液在50～60℃條件下進行旋轉蒸發(fā)，取出固體然后在27℃，-100kPa下真空常溫干燥10h即得麥醇溶蛋白；將離心后提出的固體直接進行在27℃，-100kPa下真空常溫干燥6h即為麥谷蛋白[4-7]。

利用柱層析對提取的兩種蛋白質進行純度分析。層析介質：葡聚糖凝膠G-100、柱子尺寸：1.6cm(直徑)×1m、洗脫液：麥醇溶蛋白：0.02mol/L的醋酸溶液，pH4.5；麥谷蛋白：0.05mol/L Tris-HCl，0.1mol/L KCl，pH7.5。

1.2.3 蛋白質巰基和二硫鍵的測定 首先配制好Tris-甘氨酸緩沖液、Ellman’s試劑、脲溶液、脲+鹽酸胍溶液[8]。將15mg麥醇溶蛋白或麥谷蛋白樣品加入到1mL Tris-甘氨酸緩沖液中，充分混勻后再加入4.7g固體鹽酸胍，然后用緩沖液定容至10mL待用。

巰基的測定：取定容后1mL溶液加0.05mL Ellman’s試劑以及4mL脲-鹽酸胍溶液，在412nm處測定吸光度并做平行實驗取平均值。

二硫鍵的測定：取定容后1mL溶液加入4mL脲-鹽酸胍溶液以及0.05mL二巰基乙醇，將其在25℃水浴下保溫1h，繼續(xù)加入10mL 12%的三氯乙酸后，再于25℃水浴下保溫1h，在3000r/min下離心10min，再用5mL 12%三氯乙酸清洗沉淀物，最后將沉淀溶于10mL 8mol/L的脲溶液中，加0.04mL Ellman’s試劑，在412nm處測吸光度并做平行實驗取平均值[9-10]。

巰基、二硫鍵計算公式：

巰基(SH，μmol/g)=73.53A412×D/C，其中A412是所測的吸光值，C是樣品濃度，本實驗即為15mg/mL，D為稀釋因子，計算巰基時取5.02，計算總巰基時取10。二硫鍵的量即為總巰基數減去巰基數。

1.2.4 兩種蛋白質的紅外光譜分析 對凍藏處理前后的兩種蛋白質測IR光譜，光譜范圍為4000～550cm-1，光譜分辯率為4cm-1。

1.2.5 凍藏時間對面團質構性能的影響 取面粉50g加入30mL蒸餾水制成直徑約3cm的面團，制作25個上述面團平均分為5組，除第一組不做任何處理外，其他四組先在-40℃下速凍40min，然后在-18℃下分別凍藏7、14、21、28d。凍藏處理后樣品在測定質構時需在30℃下解凍15min，然后采用物性測試儀(TPA模式)測定面團的質構性能。

具體實驗條件如下：使用質構儀P50探頭，參數設定為：測前速度:3.00mm/s，測試速度:1.00mm/s，測后速度:5.00mm/s，樣品模式:距離:5mm，間隔時間:3s，探頭類型:自動，探頭力度:5.0g。

2 結果與討論

2.1麥醇溶蛋白和麥谷蛋白提取后的純度分析

圖1、圖2分別為麥醇溶蛋白和麥谷蛋白的凝膠柱層析圖。由圖可知，提取出的麥醇溶蛋白只有一個峰，說明沒有其他物質參雜。而麥谷蛋白的層析圖出現兩個峰則是由于麥谷蛋白有低相對分子質量亞基和高相對分子質量亞基所致。所以兩種提取蛋白純度較高，可以進一步分析研究使用。

圖1 麥醇溶蛋白柱層析圖

圖2 麥谷蛋白柱層析圖

2.2凍藏時間對麥醇溶蛋白和麥谷蛋白巰基和二硫鍵的影響

巰基和二硫鍵對維持蛋白質結構有重要作用。將速凍40min后的濕面筋蛋白放入-18℃下貯藏0～30d，凍藏時間分別為0、7、14、21、28d，再從中提出兩種蛋白質分別測定巰基和二硫鍵的含量，以觀察凍藏時間對麥醇溶蛋白和麥谷蛋白的巰基和二硫鍵的影響。

從圖3和圖4中可以看出，小麥醇溶蛋白和麥谷蛋白的自由巰基含量都逐漸增加，二硫鍵含量都逐漸降低。造成這種結果的原因有兩方面，一是凍藏過程中冰晶隨凍藏時間不斷生長或重結晶，這種機械力使面筋蛋白的結構發(fā)生改變，導致蛋白分子內外部的二硫鍵部分斷裂、分子內部的巰基暴露，進而使游離的巰基含量增加。另外則是由于自由水含量的減少，凍藏處理會引起濃縮效應，使蛋白質分子內和分子間二硫鍵交換反應增多[11]。

圖3 凍藏時間對麥醇溶蛋白巰基和二硫鍵的影響

圖4 凍藏時間對麥谷蛋白巰基和二硫鍵的影響

總體來看，麥谷蛋白的巰基和二硫鍵變化程度均要大于醇溶蛋白的巰基和二硫鍵變化程度。這可能是由兩方面原因造成的：一是因為兩種蛋白的結構不同，麥醇溶蛋白的二硫鍵均分布在分子內部，與外部環(huán)境有一定隔離，而麥谷蛋白分子外部也有裸露的二硫鍵，這些二硫鍵容易受到影響而發(fā)生斷裂，故麥谷蛋白的變化程度要大于麥醇溶蛋白。二是由面筋蛋白的結構決定的，在面筋形成過程中，醇溶蛋白與麥谷蛋白相互作用，醇溶蛋白進入麥谷蛋白之中，麥谷蛋白起著拉動和包裹的作用，在面筋蛋白的外側，而醇溶蛋白則相對在內側[12]。由于麥谷蛋白緊鄰外部環(huán)境，所以可能在速凍過程中受到環(huán)境的影響也比較大。

2.3凍藏處理后麥醇溶蛋白和麥谷蛋白的紅外光譜分析

2.3.1 蛋白質紅外酰胺Ⅲ帶各峰的指認標準[14]其中α-螺旋的峰位置在1330～1290cm-1，β-折疊的峰位置在1220～1250cm-1，β-轉角的峰位置在1265～1295cm-1。

2.3.2 凍藏處理麥醇蛋白、麥谷蛋白的二級結構指認、各結構含量及分析 通過去卷積和二階導數處理的紅外光譜酰胺Ⅲ帶(1220～1330cm-1)的方法來研究凍藏時間對麥醇溶蛋白、麥谷蛋白二級結構的影響。

圖5為凍藏0、14、28d后麥醇溶蛋白的紅外光譜酰胺Ⅲ帶原始圖，經去卷積、二階導數處理后，麥醇蛋白酰胺Ⅲ帶中的各子峰的結構歸屬見表1；圖6為凍藏0、14、28d后麥谷蛋白的紅外光譜酰胺Ⅲ帶原始圖，經去卷積、二階導數處理后，麥谷蛋白酰胺Ⅲ帶中的各子峰的結構歸屬見表2。經凍藏處理后的麥醇溶蛋白、麥谷蛋白根據其各子峰面積占總峰面積的比等于對應結構含量的原則，對麥醇溶蛋白樣品中各結構的含量進行計算(表1、表2)。

圖5 凍藏處理0～28d后麥醇溶蛋白的紅外光譜去卷積酰胺Ⅲ帶

圖6 凍藏處理0～28d后麥谷蛋白的紅外光譜去卷積酰胺Ⅲ帶

結構單元峰位置(cm-1)峰面積比例(%)0d14d28dβ-折疊1220123751.453.856.8α-螺旋1310133022.520.619.6β-轉角127926.125.623.6

由表1可知，與未凍藏的麥醇溶蛋白相比，經凍藏處理后，其二級結構中α-螺旋、β-轉角的含量也隨著凍藏時間的延長逐漸減少，而β-折疊的含量則隨著凍藏時間增加。

由表2可知，與未凍藏的麥谷蛋白相比，經凍藏處理后，其二級結構中α-螺旋和β-轉角的含量隨著凍藏時間的延長顯著減少，而β-折疊則隨著凍藏時間明顯增加。

表2 凍藏處理0～28d后麥谷蛋白的 二級結構指認及各結構含量

由表1、表2可知，隨著凍藏時間的增加，兩種蛋白中的α-螺旋和β-轉角的含量逐漸減少，β-折疊的含量持續(xù)增加。α-螺旋和β-轉角減少是由于在凍藏過程中水合環(huán)境的改變，冰晶生長產生的機械力、自由水的減少使維持α-螺旋、β-轉角的氫鍵斷裂、減少，螺旋和轉角結構遭到了破壞，形成小分子物質，在自由水減少的同時，小分子物質在非共價鍵的作用下發(fā)生相互聚集，從而使β-折疊含量升高。

麥醇溶蛋白為球狀蛋白，麥谷蛋白多為大聚體。對比表1、表2可以看出麥谷蛋白中β-轉角的含量明顯少于麥醇溶蛋白，這是由于β-轉角通常出現在球狀蛋白表面的緣故。而麥谷蛋白α-螺旋和β-折疊的巨大變化是由于麥谷蛋白接觸水合環(huán)境的面積遠遠大于麥醇溶蛋白，麥谷蛋白受水合環(huán)境的影響大，則對其α-螺旋結構的破壞程度和蛋白質聚集的加劇程度也比醇溶蛋白要大。

2.4凍藏時間對面團質構性能的影響

食品的TPA測定是指在對人們進食時咀嚼力的分析基礎上，對食品機械特性中的硬度、粘著性、彈性、恢復性、咀嚼性等給以定量的評價。模擬進食時咀嚼動作對食品進行處理，從而能得到其在受力過程中所表現出的特性變化規(guī)律，不同的食品一般具有差別很大的質構性能。表3是在分別凍藏處理0、7、14、28d后，面團的TPA實驗測定結果。

表3 凍藏時間對面團質構性能的影響

由表3可以看出，隨著凍藏時間的延長，面團的各種質構性能均不同程度的下降，其中硬度、粘性和咀嚼性在0～7d內變化比較大，而彈性、回復性則在14～28d內變化比較大。

麥醇溶蛋白為單體蛋白，球形，與麥谷蛋白相比，表面積較小，分子間作用比較弱，其對面團的粘性和延展性起決定作用[15]。由于冷凍過程使醇溶蛋白二硫鍵減少，醇溶蛋白分子內部結構強度降低，則不可避免地造成面團的延展性降低；而β-轉角對蛋白質的粘性有重要影響[16]，凍藏后的麥醇溶蛋白紅外圖譜中β-轉角的減少則會導致面團粘性降低。

麥谷蛋白聚集體的主要依靠二硫鍵維持大分子結構，而麥谷蛋白聚集體又是面團彈性和硬度的決定性因素，所以麥谷蛋白二硫鍵的減少導致麥谷蛋白大聚體的減少，這是面團的彈性和硬度降低的主要原因。α-螺旋結構性質穩(wěn)定，堅韌又富有彈性，其含量的減少對面團的彈性和硬度的降低也起著重要作用。麥谷蛋白大聚體的形成會促進β-折疊的形成，但β-折疊結構的增多并不能完全說明麥谷蛋白大聚體數量的增多[14]。麥谷蛋白又是決定烘焙品質的主要因素，其與面團的強度和烘焙后面包的持氣能力有非常重要的關系，冷凍對其結構的影響也直接導致面團強度下降，烘焙后產品的品質降低[13]。

3 結論

隨著速凍時間的延長，兩種蛋白質中的巰基含量增加，二硫鍵的含量減少。隨著凍藏時間的延長，兩種蛋白質中的α-螺旋、β-轉角結構含量下降，而β-折疊結構則升高。

從實驗中看出，麥谷蛋白巰基、二硫鍵、α-螺旋、β-轉角和β-折疊含量的變化程度均大于麥醇溶蛋白，這可能是由于面筋蛋白形成時麥谷蛋白對麥醇溶蛋白的包裹、拉伸以及麥谷蛋白、醇溶蛋白本身的結構不同造成的結果。

通過質構性能的測定將面團性質的變化與兩種蛋白二級結構的變化聯系起來，實驗表明速凍和凍藏對于麥谷蛋白和麥醇溶蛋白的結構有較大的影響，而兩種蛋白質結構的變化使面團的性質也發(fā)生了很大的變化。我們可以通過保護兩種蛋白質的結構來提高面團品質。

[1]Yi Jinhee，William L，Kerr. Combined effects of freezing rate，storage temperature and time on bread dough and baking properties[J]. Food Science and Technology，2009，42(9)：1474-1483.

[2]Phimolsiripol Y,Siripatrawan U. Effects of freezing and temperature fluctuations during frozen storage on frozen dough and bread quality[J]. Journal of Food Engineering，2008，84(1)：48-56.

[3]劉國琴，柳小軍，李琳，等.凍藏時間對小麥濕面筋蛋白結構和熱性能的影響[J].河南工業(yè)大學學報，2011，32(5):5-9.

[4]Schofield J D，Booth M R.Wheat proteins and their technological significance[J].Dvelelopments in food protein[C]. Applied Science Publication Ltd，Barking，Esses，UK.1983,2:1-65.

[5]司學芝，李建偉，王金水，等.麥醇溶蛋白和麥谷蛋白提取條件的研究[J].鄭州工程學院學報，2004,25(3):33-39.

[6]Sugimotorr，TanakaK，Kasaiz.Improved Extraction of Rice Prolamin[J].Agric Biol Chem，1986,50(9):2409-2411.

[7]劉文豪，徐志宏，孫智達. 麥谷蛋白提取工藝研究[J]. 現代食品科技，2007,24(9):888-890.

[8]羅明江，羅春霞. Ellman’s試劑比色法測定食品中蛋白質的巰基和二硫鍵[J]. 鄭州糧食學院學報，1896,1(1):92-95.

[9]鄭田要，楊曉泉.不同物理法提取高溫大豆粕中蛋白的比較研究[J]. 中國油脂，2009，34(12)：22-26.

[10]易翠平，姚惠源，謝定. 堿處理對大米蛋白分子間作用力的影響[J]. 中國糧油學報，2007，22(4):1-4.

[11]Gu Jian Hua,Beekman A. Beyond Glass Transitions:Studying the Highly Viscous and Elastic Behavior of Frozen Protein Formulations Using Low Temperature Rheology and Its Potential Implications on Protein Stability[J]. Pharm Research，2013,30(2):387-401.

[12]王亞平，安艷霞. 小麥面筋蛋白組成、結構和功能特性[J]. 糧食與油脂，2011,1(1):1-4.

[13]韓彬，Shepherd K W. 低分子量谷蛋白亞基與醇溶蛋白的關系及其對小麥烘烤品質的影響[J]. 中國農業(yè)科學，1991，2(4)：19-25.

[14]A S Sivam.，Application of FT-IR and Raman spectroscopy for the study of biopolymers in breads fortified with fibre and polyphenols[J]. Food Research International，2013,50(2)：574-585.

[15]Graveland A，Bongers P，Bosveld P. Extraction and fractionation of flour proteins[J].Journal of the Science of Food and Agriculture，1979，30(1)：71-84.

[16]Parvez I,Haris,FTIR spectroscopic characterization of protein structure in aqueous and non-aqueous media[J]. Journal of Molecular Catalysis B，1999,7(1):207-221.

Effect of the time of frozen on secondary structure of glutenin and gliadin and textural properties of dough

LIXue-hong，HUZhong-yu,LUYong,JINGXiao-yan,LIUYan-qi

(Department of Food and Bioengineering,Zhengzhou University of Light Industry，Zhengzhou 450002，China)

The changes of the contents of-SH and-SS and secondary structure in the wheat gliadin and glutenin at the condition of-18℃ for frozen storage 0～28days were investigated,and the relation of the changes of the contents of-SH and-SS and secondary structure in the wheat gliadin and glutenin were discussed. The results showed that the contents of-SS,β-folded increased,the content of-SH,α-helix,β-turn reduction decreased. These changes of glutenin were greater than gliadin. Texture results showed that:the viscosity,elasticity and hardness of frozen dough were influenced by the reduction of the contents of the SS,α-helix and β-turn structure in two proteins.

glutenin;gliadin;structure;frozen storage;texture

2013-06-13

李學紅(1969-)，女，博士，教授,研究方向：淀粉資源開發(fā)。

科技部十二五科技支撐計劃項目(2012BAD37B06-08)；2012年鄭州市科技攻關項目。

TS205.7

：A

：1002-0306(2014)01-0083-05