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(陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院,陜西西安 710062)

虎奶菇菌核多糖的溶液粘度及構(gòu)象研究

劉阿娟,張靜*,張化朋,張鵬,梁濤,孫潤(rùn)廣

(陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院,陜西西安 710062)

用剛果紅實(shí)驗(yàn)和圓二色光譜觀察了不同條件下SHNP分子在溶液中的形貌特征,研究了不同溶液體系中虎奶菇菌核多糖SHNP的比濃粘度和粒度變化情況,以判斷其分子的溶液構(gòu)象。研究表明：溫度、pH、變性劑、金屬離子等外界條件均不同程度的影響SHNP溶液的比濃粘度；在pH為12時(shí),SHNP聚集體的有效直徑呈現(xiàn)最大化；剛果紅實(shí)驗(yàn)和圓二色光譜分析表明,SHNP不具有三股螺旋結(jié)構(gòu),以無(wú)規(guī)線團(tuán)鏈構(gòu)象存在,pH、變性劑均可改變其構(gòu)象。

多糖,構(gòu)象,比濃粘度,圓二色光譜

虎奶菇,又稱虎奶菌、核耳菇、茯苓側(cè)耳、南洋茯苓等,學(xué)名菌核側(cè)耳或地核側(cè)(Pleurotus tuber-regium),為擔(dān)子菌綱口蘑科側(cè)耳屬真菌,是一種珍稀食藥用真菌,甘溫,補(bǔ)氣益血,治氣血虛弱癥[1],主要分布在我國(guó)云南省的騰沖和章鳳等地,以及馬來(lái)西亞、澳大利亞、尼日利亞和肯尼亞等,其中多糖是虎奶菇主要的活性成分,研究表明虎奶菇菌核多糖具有很好的抗腫瘤[2]、降血糖[3]、抗氧化[3]、降血脂[4]和抗病毒[5]活性,并有細(xì)胞的凝集作用[6],以及增強(qiáng)免疫力[7-8]等生物活性。多糖的生物活性主要取決于其理化性質(zhì)、一級(jí)結(jié)構(gòu)、高級(jí)結(jié)構(gòu)和立體構(gòu)型等[9-13],多糖生物活性與溶液的環(huán)境密切相關(guān),因此多糖在不同溶液中的行為和分子鏈構(gòu)象在活性發(fā)揮與構(gòu)效關(guān)系上有著非常重要的生物學(xué)意義,值得深入研究。本文對(duì)熱水提取的虎奶菇菌核多糖進(jìn)行了分離純化,通過(guò)剛果紅實(shí)驗(yàn)、圓二色光譜(CD)、粘度法(Vis)研究了虎奶菇菌核多糖的溶液行為及構(gòu)象[14-15],為虎奶菇多糖的構(gòu)效關(guān)系研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù),具有重要的理論參考價(jià)值。

1. 材料與方法

1.1材料與設(shè)備

虎奶菇菌核多糖 本實(shí)驗(yàn)室提取制備；化學(xué)試劑均為分析純。

HH-SA型恒溫水浴鍋 北京科偉永興儀器有限公司;Alphal-4型真空冷凍干燥機(jī) 德國(guó)CHRIST公司;烏氏粘度計(jì) 上海玻璃儀器一廠;JB-3型定時(shí)恒溫磁力攪拌器 上海雷磁新涇儀器有限公司;激光粒度儀 美國(guó)布魯克海文公司；圓二色譜儀 英國(guó)應(yīng)用光物理公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 虎奶菇菌核多糖的分離純化 虎奶菇菌核粉碎、過(guò)60目篩,50℃烘干,95%乙醇脫脂,再置于50℃烘箱中烘干去除殘留的乙醇,冷卻至室溫得到干燥的脫脂虎奶菇菌核粉。將其與蒸餾水以1∶30的固液比混合,在100℃下浸提2h,浸提2次,離心去上清液,透析,冷凍干燥得到棕色虎奶菇菌核粗多糖(HNP)。

稱取200mg HNP,溶解于少許蒸餾水中,離心去除不溶物質(zhì)后,將離心后的溶液上樣于DEAE一52纖維素陰離子交換柱(2.5cm×80cm),洗脫液依次為：蒸餾水、0.05mol/L NaCl、0.1mol/L NaCl、0.3mol/L NaCl,流速為每管600s,每管收集8mL左右,初步分級(jí)的組分依次命名為：WHNP、SHNP、SHNP1、SHNP2,分別依次按苯酚硫酸法[16]測(cè)每管的吸光值,合并單一峰組分,其中SHNP得率為最多。實(shí)驗(yàn)以含量最多的SHNP作為后期的研究目標(biāo),進(jìn)而將其收集、透析、真空冷凍干燥以備后用。

稱取100mg SHNP,溶于少許蒸餾水中,再離心,上清液上樣于葡萄糖凝膠G-150(SephadexG-150),以蒸餾水為洗脫液,進(jìn)一步分離純化,流速為每管450s,每管收集3mL,進(jìn)行苯酚硫酸法測(cè)定吸光值,合并單一峰組分,收集冷凍干燥,即得虎奶菇菌核多糖SHNP純品。

1.3.2 純度鑒定及單糖組成分析 對(duì)上述純化后的SHNP進(jìn)行紫外分光光度計(jì)檢測(cè);用高效液相色譜儀進(jìn)行純度鑒定及分子量測(cè)定：配制1mg/mL的上述糖液,20μL進(jìn)樣。采用氣相色譜法進(jìn)行單糖組分分析,按照文獻(xiàn)[17]制備糖腈乙?；苌镆詡錃庀嗌V分析,進(jìn)樣量為0.1μL,通過(guò)樣品的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間相比較,確定SHNP的單糖組成。

1.3.3 溶液粘度的測(cè)定 對(duì)文獻(xiàn)[18-19]的方法稍加改進(jìn),用烏氏粘度計(jì)測(cè)定不同溫度、不同濃度、不同pH下SHNP的比濃粘度。依次配濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mg/mL的MgCl2、KCl、NaCl、CaCl2溶液以及濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mg/mL的脲溶液測(cè)定SHNP溶液的比濃粘度。用烏氏粘度計(jì)在25℃測(cè)定SHNP的比濃粘度(ηsp)。

ηsp=(η/η0-1)/C

式中：η：待測(cè)溶液的粘度(mpa.s)；η0:2 0℃蒸餾水的粘度(mpa.s)；C:待測(cè)溶液的濃度(mg/mL)；ηsp：待測(cè)溶液的比濃粘度。

1.3.4 剛果紅實(shí)驗(yàn) 配制2mg/mL的SHNP溶液,取2.0mL與等體積80μmol/L剛果紅溶液均勻混合,依次加入不同體積的濃度為4mol/L的NaOH,使得NaOH的濃度從0mol/L逐漸升至0.5mol/L,室溫下靜置15min,在400～600nm范圍內(nèi),用紫外可見分光光度計(jì)對(duì)其進(jìn)行光譜掃描,記錄下該溶液在不同NaOH濃度下的最大吸收波長(zhǎng)。以不加多糖的剛果紅溶液和NaOH各濃度的混合液做參比,以溶液中NaOH的濃度為橫坐標(biāo),溶液的最大吸收波長(zhǎng)為縱坐標(biāo)作圖[20]。

1.3.5 圓二色光譜(CD)測(cè)定 參照文獻(xiàn)[21]方法,用圓二色光譜儀測(cè)定圓二色譜。將SHNP配制成1.0mg/mL的溶液與剛果紅(80μmol/L)絡(luò)合后測(cè)定CD譜,檢測(cè)波長(zhǎng)范圍180～400nm。

1.3.6 粒度分布測(cè)定 配制質(zhì)量濃度分別為0.01mg/mL,pH2、7、12的SHNP溶液,于室溫下測(cè)其在635nm波長(zhǎng)處粒度分布。觀察在不同pH下SHNP分子的粒度分布變化。

2 結(jié)果與討論

2.1 SHNP的純度鑒定及其單糖組成

紫外光譜掃描結(jié)果如圖1顯示：SHNP在200nm處有糖類物質(zhì)的特征吸收峰,在260nm和280nm無(wú)特征吸收峰,判斷SHNP分子沒(méi)有核酸和蛋白質(zhì)。經(jīng)高效液相色譜(如圖2)分析,可以看到SHNP呈單一對(duì)稱峰,進(jìn)一步表明SHNP是均一多糖單一組分,其分子量經(jīng)計(jì)算為：1.463×106u。氣相色譜分析表明SHNP是只含葡萄糖的大分子葡聚糖,可用于進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)分析和研究。

圖1 SHNP的紫外光譜掃描

圖2 SHNP的高效液相色譜圖

2.2溶液比濃粘度測(cè)定結(jié)果

2.2.1 溫度對(duì)SHNP溶液比濃粘度的影響 在不同的溫度下保溫30min后,測(cè)得的SHNP溶液比濃粘度見圖3。由圖3可知：溫度從25℃升至35℃,該多糖溶液比濃粘度增長(zhǎng)急劇,這是由于溫度升高,使糖鏈活動(dòng)能力增強(qiáng),使其無(wú)規(guī)卷曲構(gòu)象有所擴(kuò)展,導(dǎo)致比濃粘度急劇增長(zhǎng),之后的35～65℃,隨著溫度的增高,溶液的比濃粘度下降。原因是熱力作用破壞了多糖分子側(cè)鏈間的氫鍵和離子鍵,使多糖的多聚體結(jié)構(gòu)變?yōu)榈途垠w,聚合度的下降導(dǎo)致了比濃粘度下降,而在35℃升至40℃的過(guò)程中出現(xiàn)急劇減小的現(xiàn)象,說(shuō)明這種熱力破壞作用在此溫度區(qū)間表現(xiàn)的更突出,在65～80℃時(shí),SHNP的比濃粘度比較穩(wěn)定,這說(shuō)明在此溫度區(qū)間,溫度變化對(duì)其比濃粘度影響不大,多糖溶液在此溫度區(qū)間的耐熱性能比較好。

圖3 溫度對(duì)SHNP溶液比濃粘度的影響

2.2.2 濃度對(duì)SHNP溶液比濃粘度的影響 在25℃,將不同濃度的SHNP溶液恒溫30min,SHNP溶液比濃粘度結(jié)果見圖4。隨著濃度的增大,SHNP多糖的比濃粘度總體上逐淅增大,但在低濃度時(shí)(1～3mg/mL),濃度對(duì)其比濃粘度幾乎沒(méi)影響,濃度超過(guò)3mg/mL后,溶液的比濃粘度以較大的幅度增長(zhǎng)。這是因?yàn)殡S著溶液中主要的粘稠物質(zhì)為高分子SHNP,隨著其含量的增加,多糖分子相互聯(lián)結(jié)、聚合的程度增加,溶液的比濃粘度越大,這種現(xiàn)象符合一般高分子溶液的粘度特性[22]。

圖4 濃度對(duì)SHNP溶液比濃粘度的影響

2.2.3 變性劑脲對(duì)SHNP溶液比濃粘度的影響 在SHNP溶液中加入不同濃度的脲,恒溫30min后,由圖5可知：脲濃度在0.1～0.4mg/mL范圍內(nèi),隨著濃度的增加,其比濃粘度呈減小趨勢(shì),在0.4～0.6mg/mL濃度范圍內(nèi),其比濃粘度又呈現(xiàn)增加的態(tài)勢(shì),之后隨著脲濃度的增加其比濃粘度又減小。即加入的變性劑量的不同對(duì)多糖分子構(gòu)象的影響不同。這可能是變性劑在一定劑量下,會(huì)造成SHNP一些氫鍵斷裂,葡聚糖分子結(jié)構(gòu)有所收縮或伸展,使其構(gòu)象不穩(wěn)定,導(dǎo)致溶液比濃粘度減小或增大[23]。

2.2.4 pH對(duì)SHNP溶液比濃粘度的影響 圖6可知,SHNP溶液在酸性及堿性條件下,其比濃粘度比中性條件下都有所下降,在酸性條件下其比濃粘度變化不大,但堿性條件變化更突出一些。這是由于氫離子和氫氧根離子對(duì)多糖的側(cè)鏈均有一定的破壞作用,氫氧根離子的作用更強(qiáng)些。因此酸、堿度的增加都會(huì)使多糖聚合度減小,從而降低了其比濃粘度,而在酸性條件下,其比粘度基本不變,說(shuō)明了SHNP的構(gòu)象在酸性條件下比較穩(wěn)定。

圖5 脲對(duì)SHNP溶液比濃粘度的影響

圖6 pH對(duì)SHNP溶液比濃粘度的影響

2.2.5 金屬鹽離子對(duì)SHNP溶液比濃粘度的影響 圖7說(shuō)明,不同濃度的Na+、Mg2+、Ca2+的存在均可使SHNP溶液的比濃粘度有不同程度的增加,K+對(duì)其比濃粘度幾乎沒(méi)影響。隨著Mg2+、Na+濃度的增加,其比濃粘度呈增長(zhǎng)態(tài)勢(shì),而Ca2+則在濃度為0.5mol/L時(shí),多糖的比濃粘度達(dá)到最大。這可能由于多糖分子鏈中存在的羥基與某些金屬離子發(fā)生絡(luò)合作用,形成蛋箱結(jié)構(gòu)[24],構(gòu)象變化導(dǎo)致溶液比濃粘度增加；還可能是由于SHNP本身分子量很大,引起比濃粘度增大。

圖7 金屬離子對(duì)SHNP溶液比濃粘度的影響

2.3虎奶菇菌核多糖SHNP構(gòu)象的初步判定

剛果紅實(shí)驗(yàn)是研究多糖大分子構(gòu)象的一種有效方法。剛果紅是一種酸性染料,可與具有三股螺旋構(gòu)象的多糖形成配合物,其紫外最大吸收波長(zhǎng)能使剛果紅本身紫外最大吸收波長(zhǎng)發(fā)生紅移,且在一定的NaOH 濃度范圍內(nèi),配合物出現(xiàn)亞穩(wěn)區(qū)即絡(luò)合物的紫外最大吸收波長(zhǎng)急劇下降。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8所示：NaOH濃度在0～0.5mol/L范圍內(nèi)變化期間,WHNP與剛果紅形成的絡(luò)合物,其紫外最大吸收波長(zhǎng)雖也發(fā)生紅移,但最大吸收波長(zhǎng)增長(zhǎng)的緩慢,并沒(méi)有發(fā)生急劇下降的現(xiàn)象,即未曾出現(xiàn)亞穩(wěn)態(tài)區(qū),這說(shuō)明虎奶菇菌核多糖SHNP不具有三股螺旋結(jié)構(gòu)[25]。與右旋糖酐無(wú)規(guī)線團(tuán)鏈構(gòu)象類似[26],說(shuō)明SHNP在水溶液中以呈無(wú)規(guī)線團(tuán)(random coil)鏈構(gòu)象存在。

圖8 虎奶菇菌核多糖SHNP-剛果紅絡(luò)合物的 最大吸收波長(zhǎng)變化

2.4圓二色光譜(CD)分析SHNP構(gòu)象

2.4.1 Ca2+添加對(duì)SHNP多糖構(gòu)象的影響 圓二色光譜(CD)是一種差光譜,是樣品在左右旋偏振光照射下的吸收光譜差值。由于生物大分子基本都含有手性的基團(tuán)和結(jié)構(gòu),因此圓二色光譜可以幫助測(cè)量和觀察生物大分子的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象變化,圓二色譜對(duì)構(gòu)象變化很敏感,它可靈敏地檢測(cè)一些反應(yīng)引起的構(gòu)象變化,是研究多糖三維結(jié)構(gòu)的有效方法之一。多糖的圓二色性與其分子的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象存在一定關(guān)系。由圖9可知,Ca2+使得多糖溶液的圓二色譜正峰峰強(qiáng)度減弱,負(fù)峰強(qiáng)度增強(qiáng),但各正負(fù)峰的最大吸收位置沒(méi)有變化,在191nm附近正峰的峰面積略有減小,揭示了由于鈣離子的參與,多糖分子間通過(guò)Ca2+橋鍵使多糖空間的手性減小,SHNP鏈變得較柔順,鏈的對(duì)稱性減小,但基本構(gòu)象未發(fā)生改變[27]。

圖9 Ca2+處理的SHNP的圓二色譜

2.4.2 剛果紅對(duì)SHNP構(gòu)象的影響 結(jié)果見圖10。剛果紅的加入使得多糖圖譜在192nm處正峰減弱,214nm處負(fù)峰也有所減弱,位置未發(fā)生改變,其它各處的峰值幾乎無(wú)任何變化,沒(méi)有發(fā)生Cotton效應(yīng),表明SHNP與剛果紅發(fā)生了絡(luò)合反應(yīng),但未能其形成有多股螺旋的特征絡(luò)合物,進(jìn)一步也揭示了前面的剛果紅實(shí)驗(yàn)。SHNP不存在具有多股螺旋的構(gòu)象,以無(wú)規(guī)線團(tuán)鏈構(gòu)象存在于溶液中。

圖10 剛果紅處理的SHNP的圓二色譜

2.4.3 二甲基亞砜(DMSO)對(duì)SHNP多糖構(gòu)象的影響 圓二色光譜圖(CD)顯示：DMSO的加入使其圖譜出現(xiàn)了突然一個(gè)高峰(或一個(gè)低谷)緊接著又一個(gè)低谷(或高峰)的Cotton效應(yīng)[28-29]DMSO的入在很大程度上破壞了多糖分子內(nèi)和分子間氫鍵相互作用,增加了多糖分子(C-O和O-H)的不對(duì)稱性,使得多糖分子的圓二色譜發(fā)生較大變化,揭示了DMSO的參與使得SHNP構(gòu)象發(fā)生較大變化。

圖11 二甲基亞砜處理的SHNP的圓二色譜

2.4.4 pH對(duì)多糖構(gòu)象的影響 圓二色譜圖(CD)顯示：在pH2時(shí)只是峰的強(qiáng)弱發(fā)生了稍許的變化,其他位置基本不變,而在pH12條件下,正峰強(qiáng)度顯著增強(qiáng),負(fù)峰位置及強(qiáng)度也發(fā)生了變化,這很可能是由于堿性條件下使得分子間或分子內(nèi)的氫鍵鍵和作用發(fā)生改變導(dǎo)致的,說(shuō)明了SHNP多糖在酸性條件下結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定,而堿性條件可能會(huì)使其構(gòu)象發(fā)生改變。

圖12 不同pH處理下SHNP的圓二色譜

2.5 SHNP的粒度分布分析

激光粒度分布測(cè)定結(jié)果顯示：不同pH下,SHNP粒度分布不同,SHNP多糖聚集體大小依次為：堿性>中性>酸性,其中在酸性與中性環(huán)境中的聚集體的有效直徑接近,說(shuō)明酸性環(huán)境對(duì)此多糖分子間及分子內(nèi)的相互作用影響比較小,而堿性環(huán)境影響較大,使其分子間或分子內(nèi)的作用增強(qiáng),使其構(gòu)象結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,從而聚集作用比較顯著。

表1 不同pH時(shí)的粒度分布變化

3 結(jié)論

虎奶菇菌核多糖的比濃粘度,在溫度未達(dá)35℃之前,其隨溫度的升高而增大,超過(guò)35℃,比粘度隨溫度的升高而減小,由于熱力作用破壞了多糖分子側(cè)鏈間的氫鍵和離子鍵,使多糖的多聚體結(jié)構(gòu)變?yōu)榈途垠w,聚合度的下降導(dǎo)致了粘度下降；SHNP溶液的比濃粘度總體上是隨著其濃度的增大而增大,這可能由于隨著多糖分子含量的增大,分子相互聯(lián)結(jié)、聚合程度增加,溶液的粘度越大；SHNP溶液的比濃粘度在中性條件下為最大,酸堿性的升高均可使其比粘度減小,這是由于氫離子和氫氧根離子對(duì)多糖的側(cè)鏈均有一定的破壞作用,使多糖聚合度減小,從而降低了其比粘度;Na+、Ca2+及Mg2+的加入均可使SHNP的比粘度升高,而K+對(duì)其影響的程度很小。這說(shuō)明多糖分子鏈中存在的羥基與某些金屬離子發(fā)生絡(luò)合作用也會(huì)對(duì)糖比粘度的有影響。圓二色譜和剛果紅實(shí)驗(yàn)表明：虎奶菇菌核多糖SHNP不具三股螺旋鏈構(gòu)象,為無(wú)規(guī)線團(tuán)鏈構(gòu)象。隨著溶液環(huán)境的變化,SHNP具備不同的存在形態(tài)。不同pH溶液,變性劑DSMO(脲)的加入均可使其構(gòu)象發(fā)生改變。

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Research of the solution viscosity and conformation character of polysaccharide from the mushroom sclerotia of pleurotus tuber-regium

LIUA-juan,ZHANGJing*,ZHANGHua-peng,ZHANGPeng,LIANGTao,SUNRun-guang

(College of Food Engineering and Nutrition Science,Shannxi Normal University,Xi’an 710062,China)

Congo-red reaction and the technique of CD were used to observe morphology of polysaccharides(SHNP)from Pleurotus tuber-regium. Inherent viscosity and the particle size distribution changes of the SHNP in different solution were studied to determine conformation of SHNP in solution. The results indicated that:the external conditions such as temperature,pH,denaturants and metal ions etc could affect SHNP to differ extent. The particle size of SHNP became bigger in the addition of NaOH. Congo-red reaction and the technique of CD showed that SHNP did not have the triple helix structure,while it was a random coil chain conformation,pH and denaturants could cause the SHNP conformation change.

polysaccharides;pleurotus tuber-regium；conformation；inherent viscosity;circular dichrosim spectroscopy

2013-03-11 *通訊聯(lián)系人

劉阿娟(1986-),女,碩士,主要從事天然產(chǎn)物有效成分的化學(xué)研究。

國(guó)家自然科學(xué)基金(10874108)；陜西省自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計(jì)劃(SJ08A16)資助。

TS201.2

：A

：1002-0306(2014)01-0128-05