,,, ,, ,

(海南大學(xué)材料與化工學(xué)院,熱帶作物種質(zhì)資源保護(hù)與開發(fā)利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,海南海口 570228)

氮對(duì)纖維藻生長、油脂積累及營養(yǎng)吸收的影響

張森,劉平懷*,王麗波,楊勛,郝宗娣,張玲,羅寧

(海南大學(xué)材料與化工學(xué)院,熱帶作物種質(zhì)資源保護(hù)與開發(fā)利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,海南海口 570228)

為研究氮源及氮濃度對(duì)一株淡水富油纖維藻(Ankistrodsemussp.)生長、油脂積累及營養(yǎng)吸收的影響。以3N-BBM為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,采用單因素實(shí)驗(yàn)分別考察了尿素、氯化銨、硝酸鈉及亞硝酸鈉以及硝酸鈉濃度對(duì)纖維藻生長、油脂積累及營養(yǎng)吸收的影響。結(jié)果表明：四種氮源對(duì)纖維藻生長和生物量影響較小,但對(duì)油脂積累影響較大。該藻在尿素中的生物量濃度最高(2.87g/L),在硝酸鈉中的油脂含量(30.17%)和油脂產(chǎn)量(0.81g/L)最高。硝酸鈉濃度為0.3mmol/L時(shí),該藻較難存活,濃度為3.0mmol/L時(shí)其生長較差,但油脂含量(37.37%)和油脂產(chǎn)量(0.89g/L)最高；濃度在9.0～30.0mmol/L時(shí),纖維藻生物量較高,但油脂含量和油脂產(chǎn)量較低。綜合生物量和油脂含量考慮,該纖維藻最適生長和油脂積累的氮源為硝酸鈉且最適濃度為3.0mmol/L。

纖維藻,氮,細(xì)胞生長,油脂積累

微藻富含蛋白質(zhì),脂肪,EPA(二十碳五烯酸)等多種生物活性物質(zhì),開發(fā)微藻已經(jīng)成為人類獲得食品,藥品及燃料等的新途徑[1]。尤其近年來,應(yīng)用微藻油脂制備生物柴油已經(jīng)引起全世界能源工作者的廣泛關(guān)注[2]。與傳統(tǒng)的油料作物相比,微藻生長速率快,油脂含量高,單位面積的年生產(chǎn)量是普通作物的幾十到上百倍[3]。盡管利用微藻生產(chǎn)油脂產(chǎn)品具有上述諸多優(yōu)點(diǎn),但是高密度培養(yǎng)[4]一直是微藻油脂產(chǎn)業(yè)化的主要瓶頸之一,探索影響微藻高密度生長和油脂積累的因素具有重要意義。影響微藻生長和油脂積累的因素很多,其中營養(yǎng)因素最為重要。氮是生物體蛋白質(zhì)和核酸的基本物質(zhì)元素,對(duì)細(xì)胞的增殖和油脂積累具有重要的調(diào)控作用。Neochlorisoleoabundans[5]在以硝酸鈉為氮源時(shí),生長最快,生物量、油脂含量和油脂產(chǎn)率最高,且氮源在3mmol/L下油脂含量最高,5mmol/L下總脂產(chǎn)量最高。Ellipsoidionsp.[6]在尿素中生長最差,在NH4Cl中的油脂產(chǎn)率最高。Scenedesmussp.[7]在2.5mg/L的氮濃度中長生最差,生物量最低但油脂含量較高,而在25mg/L時(shí),生物量和油脂產(chǎn)率最高。纖維藻隸屬于綠藻門,綠藻綱,綠球藻目,亂囊藻科,纖維藻屬,適應(yīng)性較強(qiáng),常作為濾食性魚類等餌料[8],目前對(duì)其產(chǎn)油方面研究較少。本研究以海南本地淡水分離篩選的一株富油纖維藻(Ankistrodsemussp.)為材料,初步研究和考察氮源和氮濃度對(duì)纖維藻生長和油脂積累的影響,為其高密度培養(yǎng)和產(chǎn)油條件提供參考。

表1 纖維藻Ankistrodsemus sp.在不同氮源中的生物量濃度及比生長速率

注:表中具有相同字母的組表示無顯著相差異,反之,則具有顯著性差異。表2、圖3及圖6同。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

纖維藻(Ankistrodsemussp.) 海南大學(xué)生物工程綜合實(shí)驗(yàn)室提供；硝酸鈉、亞硝酸鈉、尿素、氯化銨、氯仿、甲醇等 均為國產(chǎn)分析純。

TV-1810紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用；CR-22GII高速冷凍離心機(jī) 日立；LDJ-25C冷凍干燥系統(tǒng) 北京四環(huán)科學(xué)儀器有限公司；柱狀玻璃管高60cm,直徑6cm。

1.2培養(yǎng)條件

柱狀培養(yǎng)管中裝1L培養(yǎng)液,接種比例1∶10(v/v),連續(xù)光照,光照強(qiáng)度為8000Lux,室溫下培養(yǎng),并通入無菌空氣,通氣速率為10L/h。

1.3實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 氮源對(duì)纖維藻生長及油脂含量的影響 培養(yǎng)基(除氮源外)按3N-BBM培養(yǎng)基配制,分別用與3N-BBM原配方中相同氮摩爾濃度(8.8mmoL/L)的硝酸鈉、亞硝酸鈉、氯化銨及尿素作為唯一氮源,每組實(shí)驗(yàn)做兩組平行。

1.3.2 氮濃度對(duì)纖維藻生長及油脂含量的影響 分別以摩爾濃度為0.3、3.0、9.0、18.0、30.0mmoL/L的硝酸鈉為氮源,以1.5mmol/L的KH2PO4為磷源,其他成分按3N-BBM培養(yǎng)基配制,每組實(shí)驗(yàn)做兩組平行。

1.4分析方法

1.4.1 生長曲線及比生長速率 采用紫外可見分光光度儀測(cè)定藻溶液在680nm處的吸光值(OD680),并用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)相應(yīng)濃度下的微藻細(xì)胞個(gè)數(shù)(N),建立微藻的細(xì)胞數(shù)(N)與吸光度(OD680)的標(biāo)準(zhǔn)曲線[9],曲線方程為：N=1.55×107×OD680-361410(R2=0.99859)。培養(yǎng)期間,每24h取樣10mL,在680nm下測(cè)定吸光值,按照上述公式轉(zhuǎn)換成細(xì)胞數(shù)。比生長速率按公式μ=(lnN1-lnN2)/(T1-T2),(N1,N2分別為T1,T2時(shí)間點(diǎn)對(duì)應(yīng)的細(xì)胞數(shù)目)。

1.4.2 色素含量測(cè)定 采用90%甲醇按照文獻(xiàn)[10]中分光光度法進(jìn)行色素含量測(cè)定。

1.4.3 生物量濃度測(cè)定 將藻液于8000r/min離心5min,所得藻泥用去離子水清洗3次,然后采用真空冷凍干燥法進(jìn)行干燥。生物量濃度采用公式：生物量濃度(g/L)=凍干藻粉(g)/培養(yǎng)液體積(L)進(jìn)行計(jì)算。

1.4.4 油脂含量測(cè)定 參考文獻(xiàn)[11]氯仿-甲醇(2∶1,v/v)法對(duì)總脂進(jìn)行提取和測(cè)定。

1.4.5 氮、磷濃度測(cè)定 取5mL藻液于4000r/min下離心15min,取上層清液進(jìn)行適當(dāng)稀釋后按照文獻(xiàn)[12-14]中的過硫酸鉀消解紫外分光光度法和鉬酸銨分光光度法分別對(duì)培養(yǎng)液中總氮及總磷濃度進(jìn)行測(cè)定。

1.4.6 數(shù)據(jù)處理與分析 分別采用SPSS 20.0和Oringin 8.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和圖形繪制。

2 結(jié)果與討論

2.1氮源對(duì)纖維藻生長及油脂含量的影響

藻類通常對(duì)不同形態(tài)氮的利用存在明顯差異,浮游植物一般利用無機(jī)氮的能力為銨態(tài)氮>硝態(tài)氮>亞硝態(tài)氮[15]。由圖1可以看出,纖維藻以氯化銨和亞硝酸鈉為氮源時(shí)生長最佳,尿素次之,硝酸鈉最差。同時(shí),氯化銨比生長速率最高,亞硝酸次之,和氯化銨相差不大,而尿素和硝酸鈉沒有差異?？梢钥闯龅磳?duì)纖維藻細(xì)胞生長的促進(jìn)作用為氯化銨≈亞硝酸鈉>尿素>硝酸鈉,說明對(duì)無機(jī)氮而言,纖維藻可能較傾向于優(yōu)先利用還原態(tài)的氮,而有機(jī)氮如尿素可能需要經(jīng)過分解轉(zhuǎn)化成無機(jī)氮才能夠利用。

圖1 Ankistrodsemus sp.在不同氮源中的生長曲線

生物量(表1)表明尿素組的生物量濃度最高,氯化銨組和亞硝酸鈉組相同,硝酸鈉組最低,可能由于尿素不僅是氮源而且還具有一定的碳源作用,所以生物量較高。單因素ANVOA分析表明,四種氮源對(duì)纖維藻的生物量無顯著性差異(p=0.850>0.05),說明四種形態(tài)氮源對(duì)纖維藻生物量積累的影響較小。

葉綠素濃度的高低反映了光合作用的強(qiáng)弱,由圖2可以看出,纖維藻在0～8d色素濃度逐漸增高,光合作用隨著細(xì)胞濃度增大而增強(qiáng)。8～18d色素濃度基本穩(wěn)定不變,光合作用達(dá)到飽和。18～19d色素濃度降低,光合作用減弱。此外可以看出,纖維藻在四種氮源中的色素濃度較高,變化趨勢(shì)一致且相差不大,說明纖維藻在四種氮源中的生長都較旺盛,光合作用較強(qiáng)。

圖2 Ankistrodsemus sp.在不同氮源中葉綠素濃度變化

由圖3可以看出,纖維藻以硝酸鈉為氮源時(shí)油脂含量最高,為30.17%,是油脂含量最低的尿素組的1.26倍。單因素ANVOA分析表明四種氮源對(duì)纖維藻油脂含量具有極顯著的影響,Turkey HSD分析結(jié)果顯示亞硝酸鈉和硝酸鈉組油脂含量無顯著差異(p=0.291>0.05),其余各組間均具有顯著差異。從總脂產(chǎn)量方面考慮,硝酸鈉組最高,為0.81g/L,是產(chǎn)量最低的尿素組的1.17倍。Turkey HSD分析表明硝酸鈉和亞硝酸鈉組油脂產(chǎn)量無顯著差異(p=0.929>0.05),氯化銨和尿素組無顯著差異(p=0.783>0.05),說明氧化態(tài)的氮較還原態(tài)的氮更有利于纖維藻細(xì)胞內(nèi)油脂的積累。四種氮源中硝酸鈉為纖維藻油脂積累的最適氮源。

圖3 不同氮源下Ankistrodsemus sp.的油脂含量及油脂產(chǎn)量

2.2氮濃度對(duì)纖維藻生長及油脂含量的影響

由圖4可以看出,纖維藻在9.0、18.0mmol/L硝酸鈉下生長狀況最佳,30.0mmol/L次之,3.0mmol/L下生長較差,0.3mmol/L組只生長了3d就開始衰退。18.0mmol/L組比生長速率(表2)最高,和9.0、30.0mmol/L組的比生長速率差異較小,0.3mmol/L組的比生長速率最低。從圖5可以看出,18.0mmol/L的葉綠素濃度最高,其次分別為30.0、9.0mmol/L組,3.0mmol/L組葉綠素濃度最低,說明纖維藻在18.0mmol/L氮濃度中光合作用最強(qiáng),生長最旺盛,在3.0mmol/L中光合作用較弱,生長較差。

圖4 Ankistrodsemus sp.在不同氮濃度下的生長曲線

生物量濃度(表2)結(jié)果顯示纖維藻在18.0mmol/L中的氮濃度下生物量濃度最高,分別是0.3、3.0、9.0、30.0mmol/L濃度下的15.96、1.54、1.10、1.14倍。30.0mmol/L組的生長速率、色素濃度及生物量均較18.0mmol/L組低,說明過高的氮濃度可能對(duì)纖維藻的生長和生物量積累有抑制作用,而缺氮或氮限制(0.3mmol/L)下,纖維藻可能難以生長和存活。Turkey HSD分析顯示除0.3mmol/L組外,其余各組間的生物量濃度均無顯著性差異,說明在3.0～30.0mmol/L濃度的硝酸鈉對(duì)纖維藻生物量積累的影響較小。綜上,18.0mmol/L的硝酸鈉是纖維藻生物量積累的最適氮源濃度。

圖5 Ankistrodsemus sp.在不同氮濃度下葉綠素濃度變化

纖維藻在3.0mmol/L的氮濃度下油脂含量最高,為37.37%,分別是0.3、9.0、18.0、30.0mmol/L濃度下的2.12、1.81、2.09、2.18倍。研究表明微藻在缺氮或氮限制條件下,細(xì)胞內(nèi)積累大量油脂[16-18],這與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果不一致,可能因?yàn)樵谌钡虻拗茽顟B(tài)下,該株纖維藻基本難以生長或存活,在細(xì)胞內(nèi)還未開始積累油脂時(shí)已經(jīng)死亡。Turkey HSD分析顯示除3.0mmol/L與其余各組具有極顯著差異外,其余各組均無顯著性差異,說明低氮濃度能明顯利于該株纖維藻細(xì)胞內(nèi)的油脂積累,過高或過低的氮濃度均不利于其油脂積累。從總脂產(chǎn)量(圖6)考慮,3.0mmol/L組的油脂產(chǎn)量最高,分別是0.3、9.0、18.0、30.0mmol/L氮濃度下的22.25、1.29、1.37、1.62倍,Turkey HSD分析顯示0.3、3.0mmol/L與其余各組間均具有顯著性差異,而9.0、18.0、30.0mmol/L三組間無顯著性差異,說明9.0～30.0mmol/L氮濃度對(duì)該株纖維藻油脂產(chǎn)量影響較小。綜上,3.0mmol/L硝酸鈉最適合該株纖維藻油脂的積累。

表2 纖維藻Ankistrodsemus sp.在不同氮濃度下的生物量濃度及平均比生長速率

圖6 Ankistrodsemus sp.在不同氮濃度中的 油脂含量及油脂產(chǎn)量

2.3纖維藻對(duì)培養(yǎng)液中氮、磷的吸收利用

從圖7可以看出,3.0mmol/L組的氮源在第5d被完全消耗,9.0mmol/L組在第8d被消耗盡,18.0及30.0mmol/L組在第10～14d氮濃度吸收趨于平穩(wěn),最終都存在氮剩余,其中氮利用率分別為79.81%,37.29%。隨氮濃度升高,氮的利用率降低,可能因?yàn)槔w維藻對(duì)氮濃度的吸收存在飽和濃度,超出此濃度可能對(duì)纖維藻生長產(chǎn)生抑制作用[2]。所有組的磷源在第12～13d被完全消耗,吸收利用速率相差不大。對(duì)比氮、磷消耗曲線可以發(fā)現(xiàn),3.0和9.0mmol/L組的氮源分別在第5,8d被完全消耗,而磷的吸收還在繼續(xù),說明該株纖維藻在一定氮濃度下,對(duì)磷的吸收影響較小。對(duì)比氮消耗曲線和色素含量變化曲線可以發(fā)現(xiàn),氮被完全消耗或不再吸收的同時(shí),色素濃度基本穩(wěn)定不變,可見氮源中有一部分氮可能被直接用來合成葉綠素(葉綠素分子含有氮元素)。對(duì)比氮消耗曲線和纖維藻生長曲線可以看出,在氮源被完全消耗或基本不再吸收時(shí),細(xì)胞還在繼續(xù)增殖,這和Li等[2]的研究結(jié)果一致,說明纖維藻細(xì)胞內(nèi)可能存在儲(chǔ)存氮源的“氮池”,培養(yǎng)基中的氮源可能在吸收過程中有一部分被儲(chǔ)存起來,等培養(yǎng)基中的氮完全被消耗完時(shí),被儲(chǔ)存的氮此時(shí)才被調(diào)用。

圖7 培養(yǎng)基中氮、磷濃度變化

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)以3N-BBM為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,研究了不同氮源及硝酸鈉濃度對(duì)一株淡水纖維藻生長、油脂積累及營養(yǎng)吸收的影響。纖維藻以氯化銨、硝酸鈉、亞硝酸鈉及尿素為氮源時(shí),對(duì)纖維藻生物量無顯著影響,但對(duì)油脂積累影響較大。其在尿素中的生物量濃度最高(2.87g/L),但油脂含量較低,在硝酸鈉中的油脂含量(30.17%)和油脂產(chǎn)量(0.81g/L)最高。硝酸鈉濃度為0.3mmol/L時(shí),纖維藻生長較差,較難存活；濃度為3.0mmol/L時(shí)纖維藻生長較差,生物量濃度較低,但油脂含量(37.37%)和油脂產(chǎn)量(0.89g/L)最高；濃度為9.0～30.0mmol/L氮濃度下該株纖維藻生長旺盛,生物量較高,但油脂含量和油脂產(chǎn)量較低,且生物量和油脂產(chǎn)量沒有顯著差異。在實(shí)驗(yàn)條件下,纖維藻利用氮的飽和濃度小于18.0mmol/L,更高氮濃度不僅不會(huì)促進(jìn)纖維藻的生長和生物量積累,還會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞積累油脂水平下降。綜上,四種氮源中,最適纖維藻生長和油脂積累的氮源為硝酸鈉且最適濃度為3.0mmol/L。

[1]汪本凡,趙良俠,葉霽,等. 微藻無菌化技術(shù)的研究進(jìn)展[J]. 微生物學(xué)通報(bào),2007,34(2)：363-366.

[2]Li X,Hu H Y,Zhang Y P. Growth and lipid accumulation properties of a freshwater microalgaScenedesmussp. under different cultivation temperature[J]. Bioresource Technology,2011,102：3098-3102.

[3]Man K L,Keat T L. Microalgae biofuels：A critical review of issues,problems and the way forward[J]. Biotechnology Advances,2012,30：673-690.

[4]Zhu J Y,Rong J F,Zong B N. Factors in mass cultivation of microalgae for biodiesel [J]. Chinese Journal of Catalysis,2013,34(1)：80-100.

[5]Li YQ,Horsman M,Wang B,etal. Effects of nitrogen sources on cell growth and lipid accumulation of green alga Neochloris oleoabundans [J]. Applied Microbiology Biotechnology,2008,81：629-636.

[6]Xu N J,Zhang X C,Fan X,etal. Effects of nitrogen source and concentration on growth rate and fatty acid composition ofEllipsoidionsp. (Eustigmatophyta) [J]. Journal of Applied Phycology,2001,13：463-469.

[7]Li X,Hu H Y,Gan K,etal. Effects of different nitrogen and phosphorus concentrations on the growth,nutrient uptake,and lipid accumulation of a freshwater microalgaScenedesmussp.[J].Bioresurce Technology,2010,10：5494-5500.

[8]王溪森,師德強(qiáng),莫祺暉. 磷對(duì)纖維藻生長的影響[J]. 河北漁業(yè),2010,8：4,27.

[9]王立柱,溫皓程,鄒渝,等. 產(chǎn)油微藻的分離、篩選及自養(yǎng)培養(yǎng)氮源、碳源的優(yōu)化[J]. 微生物學(xué)通報(bào),2010,37(3)：336-341.

[10]Lichtenthaler H K. Chlorophylls and carotenoids：pigments of photosynthetic biomembranes[J]. Methods in enzyology,1987,148：350-382

[11]劉平懷,張森,楊勛,等. 氮、磷源及海鹽對(duì)微茫藻細(xì)胞生長和油脂積累的影響[J]. 食品工業(yè)科技,2013,34(7)：186-189.

[12] GB11894-89. 水質(zhì)總氮的測(cè)定-過硫酸鉀消解紫外分光光度法[S].

[13] 國家環(huán)境保護(hù)總局《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法》編委會(huì). 水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法[M]. 第四版. 北京：中國環(huán)境科學(xué)出版社,2002,244-257.

[14] GB11893-89. 水質(zhì)總磷的測(cè)定-鉬酸銨分光光度法[S].

[15] Dortch Q,Clayton J J R,Thoresen S S. Species differences in accumulation of nitrogen pols in phytoplankton[J]. Marine Biology,1984,81：237-250.

[16] Chittra Y S,Benjamas C. Effect of nitrogen,salt,and iron content in the growth medium and light intensity on lipid production by microalgae islated from freshwater sources in Thailand[J]. Bioresource Technology,2011,102：3034-3040.

[17] Huang X X,Huang Z Z,Wen W,etal. Effects of nitrogen supplementation of the culture medium on the growth,total lipid content and fatty acid profiles of three microalgae (Tetraselmis subcordiformis,Nannochloropsis oculata and Pavlova viridis)[J]. Journal of Applied Phycology,2013,25(1)：129-137.

[18] Feng P Z,Deng Z Y,Fan L,etal. Lipid accumulation and growth characteristics of Chlorella zofingiensis under different nitrate and phosphate concentrations[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering,2012,114(4)：405-410.

Effect of nitrogen on the growth,lipid accumulation and nutrient uptak of a freshwater microalgaeAnkistrodsemussp.

ZHANGSen,LIUPing-huai*,WANGLi-bo,YANGXun,HAOZong-di,ZHANGLing,LUONing

(College of Materials and Chemical Engineering,Hainan University,Ministry of Education Key Laboratory of Protection and Development Utilization of Tropical Crop Germplasm Resources,Haikou 570228,China)

In order to study effects of nitrogen sources and concentrations on the growth,lipid accumulation,and nutrient uptake of a freshwater microalgaAnkistrodsemussp.,four nitrogen sources such as urea,ammonium chloride,sodium nitrate and sodium nitrite and different nitrogen concentrations were investigated based on 3N-BBM media. The results showed that the growth and biomass were less affected by four nitrogen sources,but it was just opposite for lipid accumulation. The highest biomass(2.87g/L)was obtained with urea as nitrogen source,while the optimal lipid content(30.17%)and lipid productivity(0.81g/L)was gained with sodium nitrate.Ankistrodsemussp. was grown poorly and nearly died just on the fourth day with 0.3mmol/L sodium nitrate. Although the growth and biomass was poor with 3mmol/L sodium nitrate,the lipid content(37.37%)and lipid productivity(0.89g/L)was highest. With higher nitrogen concentration(9.0～30.0mmol/L),Ankistrodsemussp. was grown vigorously and had higher biomass,but the lipid content and lipid productivity were lower. So sodium nitrate was the optimal nitrogen source for growth and lipid accumulation ofAnkistrodsemussp. and the optimal concentration was 3.0mmol/L.

Ankistrodsemussp.;nitrogen;cell growth;lipid accumulation

2013-05-17 *通訊聯(lián)系人

張森(1988-),男,碩士研究生,主要從事微藻生物能源及生物制藥方面研究。

國家科技支撐計(jì)劃(2011BAD14B01)；海南省中藥現(xiàn)代化科技專項(xiàng)(ZY201327)；基礎(chǔ)研究重大項(xiàng)目前期研究專項(xiàng)(2010CB134409)；海南大學(xué)植物學(xué)國家級(jí)重點(diǎn)學(xué)科(071001)資助。

Q935

：A

：1002-0306(2014)01-0155-05