, ,,, ,,*，

(1.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)與工程系,北京100083； 2.林業(yè)食品加工與安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(北京林業(yè)大學(xué)),北京 100083)

林蛙油蛋白中性蛋白酶水解物促進(jìn)脾細(xì)胞和巨噬細(xì)胞功能

郭淼1,2,崔犁1,2,翟夢新1,2,張世欣1,2,汪濤1,2,許美玉1,2,*，翁強(qiáng)1，2

(1.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)與工程系,北京100083； 2.林業(yè)食品加工與安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(北京林業(yè)大學(xué)),北京 100083)

用鹽析法結(jié)合超聲波破碎細(xì)胞處理技術(shù),從林蛙油中提取蛋白,并用中性蛋白酶制備林蛙油蛋白酶水解物。通過小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、脾淋巴細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素-2水平、巨噬細(xì)胞吞噬中性紅實(shí)驗(yàn)及巨噬細(xì)胞體外釋放NO實(shí)驗(yàn),研究林蛙油、林蛙油蛋白及其中性蛋白酶水解物對脾細(xì)胞和巨噬細(xì)胞功能的影響。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),林蛙油、林蛙油蛋白及其中性蛋白酶水解物均對脾淋巴細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的免疫功能具有不同程度的促進(jìn)作用,其中林蛙油蛋白中性蛋白酶水解物顯示較顯著的促進(jìn)作用(p<0.01)。其中性蛋白酶水解物可分別增強(qiáng)脾淋巴細(xì)胞增殖、脾淋巴細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素-2、巨噬細(xì)胞吞噬功能及巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO功能達(dá)19.3%、104.8%、109.1%及34.9%。以上結(jié)果表明,林蛙油蛋白的中性蛋白酶水解物可顯著提高脾淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞功能(p<0.01)。

林蛙油蛋白,中性蛋白酶水解物,脾淋巴細(xì)胞,巨噬細(xì)胞,免疫功能

林蛙油(Oviductus Ranae),是我國特有的保健食品,為中國林蛙雌性輸卵管的干制品,其外觀呈淡黃色半透明狀,并帶有一定的油質(zhì)性[1-2]。有研究表明,林蛙油可調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能,例如增強(qiáng)小鼠的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng),增加免疫器官重量,提高單核巨噬細(xì)胞的吞噬功能和淋巴細(xì)胞增殖能力等[2-3]。然而,林蛙油中具有調(diào)節(jié)免疫功能的活性成分,尚不清楚。近年來的研究表明,食物蛋白或蛋白酶水解物具有調(diào)節(jié)免疫功能生物活性,如云芝中的TVC蛋白,乳蛋白的酶解產(chǎn)物等[4-5]。林蛙油富含蛋白質(zhì),其含量高達(dá)50%以上[6]。林蛙油蛋白是否也具有免疫調(diào)節(jié)功能,是一個(gè)非常值得探討的課題。因機(jī)體免疫是由免疫器官和組織、免疫細(xì)胞和免疫分子組成的一個(gè)復(fù)雜的功能整體[7]。本項(xiàng)研究選擇機(jī)體重要的免疫細(xì)胞,脾淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞,主要在體外層面研究林蛙油蛋白及其酶水解物對免疫細(xì)胞功能的影響。該研究結(jié)果,對闡明林蛙油免疫調(diào)節(jié)功能的活性成分,將提供重要的科學(xué)依據(jù),對林蛙油的有效利用及深加工具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

林蛙油 吉林,冷凍樣品;中性蛋白酶 Sigma公司產(chǎn)品,美國;清潔級昆明小鼠 8周齡,雄性,北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部;小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7系 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心;小鼠白介素2(IL-2)酶聯(lián)免疫試劑盒 CUSABIO;一氧化氮檢測試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)研究所。

酶標(biāo)儀 BIO-RAD。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 林蛙油蛋白提取 將林蛙油剪碎,按1∶10的比例加入0.01mol/L的PBS緩沖液,用超聲波破碎細(xì)胞15min,在冰浴下進(jìn)行間隙冷卻(30s∶30s),于4℃、8000r/min離心20min,吸取上清液。緩慢加入固體硫酸銨,至其飽和度達(dá)到95%(25℃),靜置一段時(shí)間,以確保沉淀完全,于4℃、8000r/min離心20min,收集沉淀,透析并真空冷凍干燥。蛋白質(zhì)提取率(%)=所提取的蛋白質(zhì)量(g)/林蛙油中蛋白質(zhì)含量(g)×100。

1.2.2 林蛙油蛋白中性蛋白酶水解物制備 將林蛙油蛋白按1∶10的比例溶于水中,90℃保溫10min,調(diào)節(jié)至中性蛋白酶的最適溫度55℃和pH7.5條件下,加入蛋白酶酶解3h,然后調(diào)節(jié)pH至中性,95℃下加熱10min滅活酶,離心取上清液,真空冷凍干燥得到林蛙油蛋白的中性蛋白酶水解物[8]。

1.2.3 脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 小鼠眼球放血,脫頸處死,于無菌狀態(tài)下取脾,制備脾淋巴細(xì)胞懸浮液[9-10]。臺(tái)酚藍(lán)染色法計(jì)數(shù)細(xì)胞,存活率為90%以上。RPMI1640完全培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為5×106cells/mL鋪板,向96孔板中加入脾淋巴細(xì)胞懸液100μL/well,37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱適應(yīng)性培養(yǎng)4h。每孔加入100μL溶于完全培養(yǎng)基的待測樣品(林蛙油、林蛙油蛋白及其中性蛋白酶水解物,濃度500μg/mL),每個(gè)待測樣品設(shè)置4個(gè)復(fù)孔,培養(yǎng)48h。每孔加入10μL的噻唑蘭(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,MTT)溶液(5mg/mL),繼續(xù)培養(yǎng)4h。小心吸棄每孔上清液150μL。每孔加入150μL的二甲基亞砜(DMSO)溶液,搖板20min。酶聯(lián)免疫檢測儀570nm測定各孔吸光值OD[11-12]。以常用絲裂原Con A(10μg/mL)作為陽性對照。

1.2.4 小鼠脾細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素2(IL-2)水平測定 按1.2.2方法制備小鼠脾淋巴細(xì)胞懸浮液,調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×106cells/mL,向96孔板中加入脾淋巴細(xì)胞懸液100μL/well,培養(yǎng)4h。每孔加入100μL待測樣品,每個(gè)待測樣品設(shè)置4個(gè)復(fù)孔,培養(yǎng)48h。吸取上清液100μL,-20℃保存待測[12]。按小鼠IL-2酶聯(lián)免疫試劑盒說明書方法測定上清液中IL-2含量,以Con A作為陽性對照。

1.2.5 巨噬細(xì)胞吞噬中性紅實(shí)驗(yàn) 用DEME-高糖完全培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為3×105cells/mL鋪板,向96孔板中加RAW264.7細(xì)胞懸液100μL/well,培養(yǎng)3h。吸棄上清液,每孔加入100μL溶于完全培養(yǎng)基的待測物,培養(yǎng)48h。加入100μL中性紅溶液(濃度為0.075%,溶解在10mmol/L的PBS中,使用前用0.22μm濾膜過濾)并培養(yǎng)3h。棄去上清液,用PBS洗板2次,以除去沒有被巨噬細(xì)胞吞噬的中性紅。接著加入100μL細(xì)胞裂解液(乙醇和0.01%的乙酸比例為1∶1配制)以裂解細(xì)胞,室溫下過夜。用酶標(biāo)儀在540nm處測定吸光度值[12-13]。

1.2.6 巨噬細(xì)胞體外NO釋放實(shí)驗(yàn) RAW 264.7小鼠巨噬細(xì)胞以5×105cells/well接于96孔板中,37℃培養(yǎng)4h。吸棄上清液,每孔中加入含有2μg/mL的脂多糖(LPS)和樣品蛋白的完全培養(yǎng)基100μL/well,在37℃下培養(yǎng)20h[4]。收集上清液按照一氧化氮檢測試劑盒說明書測定。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示,用t檢驗(yàn)法比較差異,p<0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著性差異,p<0.01為極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1林蛙油蛋白及其中性蛋白酶水解物對脾淋巴細(xì)胞增殖的影響

淋巴細(xì)胞是機(jī)體最重要的免疫細(xì)胞,脾臟是機(jī)體最大的免疫器官,占全身淋巴組織總量的25%,儲(chǔ)存大量的T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞,通過檢測待測物對脾淋巴細(xì)胞增殖的影響,可最直接的反映其對免疫功能的影響[14]。本研究首先以PBS緩沖液為提取劑,用鹽析法從林蛙油中提取蛋白,提取率為35.13%(用凱氏定氮法測定干燥的林蛙油中蛋白含量為56.15%)。通過MTT細(xì)胞增殖分析實(shí)驗(yàn),在500μg/mL濃度水平,研究林蛙油、林蛙油蛋白及林蛙油蛋白中性蛋白酶水解物對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響,結(jié)果三者均具有一定促進(jìn)增殖作用(見圖1)。與空白對照相比,林蛙油、林蛙油蛋白及林蛙油蛋白酶水解物,可分別提高脾淋巴細(xì)胞的活細(xì)胞數(shù)量達(dá)5.7%、9.1%及19.3%,其中林蛙油蛋白及其蛋白酶水解物的促進(jìn)效果顯著(見圖1,p<0.05)。以上結(jié)果表明,林蛙油蛋白中性蛋白酶水解物較顯著促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞增殖。

圖1 林蛙油蛋白及其中性蛋白酶水解物 對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響

2.2林蛙油蛋白及其中性蛋白酶水解物對脾淋巴細(xì)胞分泌IL-2的影響

淋巴細(xì)胞除了本身發(fā)揮免疫功能之外,還分泌免疫分子白細(xì)胞介素-2(IL-2)。IL-2是T淋巴細(xì)胞的生長因子,并可促進(jìn)活化B淋巴細(xì)胞增殖,是機(jī)體免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中的核心物質(zhì)[6]。檢測林蛙油、林蛙油蛋白及其中性蛋白酶水解物,對小鼠脾細(xì)胞分泌IL-2的影響,結(jié)果表明均具有一定促進(jìn)作用(見圖2)。用不含實(shí)驗(yàn)樣品的培養(yǎng)基培養(yǎng)的脾淋巴細(xì)胞(對照組)分泌IL-2含量為21.23pg/mL,用分別含500μg/mL的林蛙油、林蛙油及其酶水解物的培養(yǎng)基培養(yǎng)的脾淋巴細(xì)胞,分泌IL-2含量分別為32.35、40.60和43.48pg/mL。林蛙油對小鼠脾細(xì)胞分泌IL-2具有一定的促進(jìn)作用,但效果并不顯著,林蛙油蛋白具有顯著的促進(jìn)效果(p<0.05),林蛙油蛋白的中性蛋白酶水解物的促進(jìn)作用極顯著(p<0.01),與對照組相比增加104.8%(見圖2)。以上結(jié)果表明,林蛙油蛋白中性蛋白酶水解物具有較顯著促進(jìn)脾細(xì)胞分泌IL-2作用。

圖2 林蛙油蛋白及其中性蛋白酶水解物 對小鼠脾細(xì)胞分泌IL-2水平的影響

2.3林蛙油蛋白及其中性蛋白酶水解物對巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響

巨噬細(xì)胞分布最為廣泛,是重要的機(jī)體免疫系統(tǒng)的細(xì)胞,具有吞噬、殺傷、分泌生物活性物質(zhì)及抑制腫瘤等多方面功能,其吞噬功能是免疫系統(tǒng)維持自身內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要手段[15]。RAW264.7細(xì)胞系是小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞,可通過細(xì)胞對中性紅的吞噬量來反映吞噬能力的。用含林蛙油、林蛙油蛋白及其中性蛋白酶酶水解物(濃度為500μg/mL)的完全培養(yǎng)基,培養(yǎng)小鼠巨噬細(xì)胞48h后,測定巨噬細(xì)胞吞噬中性紅染液的能力,結(jié)果表明三者均促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬功能(見圖3)。與空白對照組相比,林蛙油、林蛙油蛋白及其中性蛋白酶酶水解物,可提高巨噬細(xì)胞吞噬能力分別達(dá)24.7%、46.2%和109.1%,表明林蛙油可促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬功能,但效果不顯著,林蛙油蛋白的促進(jìn)作用顯著(p<0.05),林蛙油蛋白中性蛋白酶水解物的促進(jìn)作用極顯著(p<0.01)。以上結(jié)果表明,林蛙油蛋白中性蛋白酶水解物較顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬功能。

圖3 林蛙油蛋白及其中性蛋白酶水解物 對RAW264.7細(xì)胞的吞噬能力的影響

2.4林蛙油蛋白及其中性蛋白酶水解物對巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO能力的影響

巨噬細(xì)胞通過反應(yīng)性氮中間物作用系統(tǒng)產(chǎn)生NO,進(jìn)而發(fā)揮殺菌和抗腫瘤作用,巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的NO的量與其殺傷功能強(qiáng)弱具有密切關(guān)系[16]。檢測林蛙油、林蛙油蛋白及其中性蛋白酶水解物,對RAW264.7巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO的影響,結(jié)果表明林蛙油無明顯促進(jìn)作用,而林蛙油蛋白質(zhì)提高NO產(chǎn)量10.1%,具有顯著的促進(jìn)效果(p<0.05),林蛙油蛋白的中性蛋白酶水解物提高NO產(chǎn)量34.9%,具有極顯著的促進(jìn)效果(p<0.01)。以上結(jié)果表明,雖然林蛙油對巨噬細(xì)胞殺傷功能沒有顯示明顯的促進(jìn)作用,然而林蛙油蛋白卻顯示明顯的促進(jìn)作用,當(dāng)林蛙油蛋白被中性蛋白酶水解后較顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞殺傷功能。

圖4 林蛙油蛋白及其中性蛋白酶水解物 對RAW264.7細(xì)胞釋放NO能力的影響

3 結(jié)論

體外檢測脾淋巴細(xì)胞增殖和分泌IL-2含量、巨噬細(xì)胞吞噬功能及巨噬細(xì)胞產(chǎn)NO含量實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,林蛙油具有一定促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞功能作用,然而林蛙油組成成分之一的林蛙油蛋白的促進(jìn)作用更顯著,表明林蛙油免疫調(diào)節(jié)作用的活性成分存在于蛋白質(zhì)。當(dāng)林蛙油蛋白被中性蛋白酶水解后,更顯著提高脾淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞功能,說明以特定形式存在的肽類是林蛙油促進(jìn)免疫細(xì)胞功能的活性成分之一。中性蛋白酶可水解疏水性氨基酸亮氨酸和苯丙氨酸的氨基端及其它肽鍵[17],林蛙油蛋白中性蛋白酶水解物中促進(jìn)免疫細(xì)胞功能的活性成分也可能是末端為疏水性氨基酸的肽類。通過本項(xiàng)研究,雖然不能完全闡明林蛙油免疫調(diào)節(jié)功能的活性成分,但本項(xiàng)研究結(jié)果為進(jìn)一步深入研究林蛙油免疫調(diào)節(jié)功能的活性成分及作用機(jī)理,提供了重要的科學(xué)依據(jù)。

[1]王殿夫.即食林蛙油罐頭中污染菌的分離鑒定[J].中國釀造,2008,14：84.

[2]高峰,張海英,張琨,等.林蛙油類保健食品保健功能研究[J].中國公共衛(wèi)生,2005,21(9)：1056.

[3]韓鐵鎖,王亞軍,王新,等.東北林蛙油化學(xué)成分和藥理作用的研究進(jìn)展[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2008(4)：17-18.

[4]Li F,Wen HA,Zhang YJ,etal.Purification and characterization of a novel immunomodulatory protein from the medicinal mushroomTrametesversicolor[J].Science China,2011,54(4)：379-385.

[5]田剛,陳代文.免疫調(diào)節(jié)肽研究進(jìn)展[J].飼料營養(yǎng)研究進(jìn)展,2006：195-209.

[6]陳曉平,崔敬愛,胡耀輝.林蛙油主要營養(yǎng)成分的研究[J].食品科學(xué),2005,26(8)：361-363.

[7]李曦,尤歡,楊嚴(yán)峻.雞胚蛋提取物對體外培養(yǎng)的脾淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的影響[J].食品工業(yè)科技,2012(12)：368-370.

[8]Nagaoka S,Futamura Y,Miwa K,etal.Identification of novel

hypocholesterolemic peptides derived from bovine milk β-lactobulin[J]. Biochem Biophys Res Commun,2001,281(1):11-17.

[9]Fabian B,Maria CC,Felix CC.Invivoandinvitroimmunomodulatory activities ofTrichiliaglabraaqueousleaf extracts[J].Journal of Ethnopharmacology,2000,69:199-205.

[10]Sun HX,Qin F,Pan YJ.Invitroandinvivoimmunosuppressive activity ofSpicaPrunellaeethanolextract on the immune responses in mice[J].Journal of Ethnopharmacology,2005,101：31-36.

[11]Gomes A,Giri B,Alama A,etal.Anticancer activity of a low immunogenic protein toxin(BMP1)from Indian toad(Bufomelanostictus,Schneider)skin extract[J].Toxicon,2011,58:85-92.

[12]Xi L,Yujie S,Jun S,etal.Chicken embryo extracts enhance spleen lymphocyte and peritoneal macrophages function[J]. Journal of Ethnopharmacology,2012,144(2):255-260.

[13]Chen WX,Zhang WY,Shen WB,etal.Effects of the acid polysaccharide fraction isolated from a cultivated Cordycepssinensison macrophagesinvitro[J].Cellular Immunology,2010,262:69-74.

[14]李偉,陳青森.酪蛋白糖巨肽對小鼠腸道免疫系統(tǒng)的影響[J].食品科學(xué),2010,31(15)：240-243.

[15]田維毅,王文佳,李海峰,等.中性紅法檢測巨噬細(xì)胞吞噬功能的實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化[J].貴陽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2009,31(2)：23-26.

[16]陳娜,陳興平. 華蟾素對小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素-2水平的影響[J]. 醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2007,26(1):14-16.

[17]劉欣.食品酶學(xué)[M].北京：中國輕工業(yè)出版社,2007：51-64.

Promotion of spleen lymphocyte and macrophage functions induced by neutral protease hydrolysate of Oviductus Ranae protein

GUOMiao1,2,CUILi1,2,ZHAIMeng-xin1,2,ZHANGShi-xin1,2,WANGTao1,2,XUMei-yu1,2,*,WENGQiang1,2

(1.Department of Food Science and Engineering,College of Biological Sciences and Technology, Beijing Forestry University,Beijing 100083,China; 2. Beijing Key Laboratory of Forest Food Processing and Safety,Beijing Forestry University,Beijing 100083,China)

Protein was extracted from fresh frozen Oviductus Ranae by ammonium sulfate grade precipitation combined with ultrasonic treatment. Oviductus Ranae protein hydrolysate was prepared with neutral protease. Effect of Oviductus Ranae,Oviductus Ranae protein and neutral protease hydrolysate of Oviductus Ranae protein on functions of spleen lymphocyte and macrophage were investigated by testing proliferation of spleen lymphocyte,Interleukin-2(IL-2)secretion of spleen lymphocyte,phagocytic function of macrophage and NO production. These results showed Oviductus Ranae,Oviductus Ranae protein and neutral protease hydrolysate of Oviductus Ranae protein promoted immune functions of spleen lymphocyte and macrophage,and the neutral protease hydrolysate of Oviductus Ranae protein showed the most significant effect to improve immunefunctions(increased the proliferation of spleen lymphocyte,IL-2 secretion by spleen lymphocyte,macrophage phagocytosis and NO production by macrophages to 19.3%,104.8%,109.1% and 34.9%,respectively). These results suggested that neutral protease hydrolyzate of Oviductus Ranae protein could promote the immune functions of spleen lymphocyte and macrophage significantly(p<0.01).

Oviductus Ranae protein,neutral protease hydrolysate,spleen lymphocyte,macrophage,immunefunction

2013-05-31 *通訊聯(lián)系人

郭淼(1988-),女,碩士研究生,研究方向：營養(yǎng)與功能食品。

國家自然科學(xué)基金資助子項(xiàng)目(J1103516-2D26);北京市科委科技創(chuàng)新基地培育與發(fā)展工程項(xiàng)目(Z121106002812037)。

TS201.4

：A

：1002-0306(2014)01-0345-04