何世成，王昌建，邱立新，王衛(wèi)國，唐小明，魯杏華，林 源，范仲鑫，朱春霞，劉道新

（湖南省動物疫病預(yù)防控制中心，湖南長沙410014）

高致病性禽流感（HPAI）是養(yǎng)禽業(yè)的頭號殺手，也是具有重要公共衛(wèi)生意義的人獸共患?。?－3］。目前，我國引起HPAI的病原主要為H5亞型禽流感病毒［1－2］。我國對HPAI的防控采取免疫與撲殺相結(jié)合的綜合措施［3－4］，高免疫壓力可使 HPAI流行毒株基因變異速度加快［5－7］。為確保免疫效果，我國農(nóng)業(yè)部屢次更換HPAI疫苗種毒株，2012年6月，我國農(nóng)業(yè)部在全國范圍內(nèi)將高致病性禽流感疫苗生產(chǎn)種毒Re－5株更換為Re－6株。為掌握重組禽流感病毒滅活疫苗（H5N1亞型，Re－6株）免疫鴨的臨床效果，本試驗(yàn)選擇市場上流通的6家企業(yè)生產(chǎn)的重組禽流感病毒滅活疫苗（H5N1亞型，Re－6株）對農(nóng)村散養(yǎng)鴨進(jìn)行了臨床免疫效果研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 疫苗 A、B、C、D、E、F等6個(gè)企業(yè)生產(chǎn)的重組禽流感病毒滅活疫苗（H5N1亞型，Re－6株），試驗(yàn)用疫苗隨機(jī)取自湖南省縣級疫苗儲備庫，且均在使用有效期內(nèi)。

1.1.2 試驗(yàn)用動物及場地 漢壽縣洋淘湖鎮(zhèn)李發(fā)財(cái)?shù)傍唸觯搱鰣鲋骶哂?0年以上蛋鴨飼養(yǎng)經(jīng)驗(yàn)，場內(nèi)有近20畝水面，有良好的飼養(yǎng)棚具和優(yōu)良的防疫條件。試驗(yàn)用同批次鴨為1 000羽，試驗(yàn)期間不同群飼養(yǎng)其他鴨。

1.1.3 檢測試劑 禽流感病毒 H5（Re－6）血凝抑制試驗(yàn)抗原（批號2013002）與陽性血清（批號2013001），哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司產(chǎn)品；禽流感病毒H5亞型熒光RT－PCR檢測試劑，中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司產(chǎn)品（批號：2013001）。

1.2 方法

1.2.1 免疫試驗(yàn) 用6個(gè)廠家生產(chǎn)的疫苗同時(shí)進(jìn)行25日齡鴨免疫試驗(yàn)。試驗(yàn)分7組，其中，6個(gè)試驗(yàn)組（以A、B、C、D、E、F為組別標(biāo)識）分別用6個(gè)廠家生產(chǎn)的疫苗免疫，每組130羽，其余220羽為空白對照組（Blank），各試驗(yàn)組用塑料小標(biāo)簽作為腳標(biāo)進(jìn)行區(qū)別。免疫前，隨機(jī)采集試驗(yàn)鴨血清、咽拭子和泄殖腔拭子各30份，疫苗組每羽頸后皮下注射對應(yīng)廠家生產(chǎn)的疫苗0.5mL，空白對照組不免疫；從免疫接種后開始，連續(xù)7d，對試驗(yàn)鴨進(jìn)行臨床觀察并記錄；分別于免疫接種后14、22、29、48、77、105、133、165d進(jìn)行采樣，每組隨機(jī)采集血清、咽拭子和泄殖腔拭子各20份。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)室檢測 應(yīng)用 HA－HI試驗(yàn)［8］檢測血清中的 H5AIV（Re－6）抗體，結(jié)果依據(jù)《2013年國家動物疫病監(jiān)測與流行病學(xué)調(diào)查計(jì)劃》（農(nóng)醫(yī)發(fā)［2013］9號）判斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷，即抗體效價(jià)≥4log2判定為抗體合格，抗體合格的樣品數(shù)占同組樣品總數(shù)的比率為合格率，合格率≥70%為群體免疫合格。應(yīng)用禽流感病毒H5亞型熒光RT－PCR檢測試劑盒檢測咽拭子和泄殖腔拭子中的H5AIV核酸。

2 結(jié)果

2.1 臨床反應(yīng)情況

試驗(yàn)鴨免疫接種后連續(xù)觀察7d，均未出現(xiàn)免疫接種副反應(yīng)，精神狀況良好，食欲及生長發(fā)育正常。

2.2 試驗(yàn)鴨血清中 H5AIV（Re－6）抗體檢測結(jié)果

各組免疫接種前后血清 H5AIV（Re－6）HI抗體效價(jià)檢測結(jié)果見表1和圖1，合格率結(jié)果見表2和圖2，變異系數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表3和圖3、圖4。結(jié)果顯示，A組、B組、D組、E組、F組疫苗免疫接種后14d其平均抗體效價(jià)上升至合格效價(jià)標(biāo)準(zhǔn)（4log2）以上，并獲得70%以上的群體合格率，其中，B組、E組、F組抗體有效持續(xù)期（平均抗體效價(jià)≥4log2、群體合格率≥70%）在151d以上，A組抗體有效持續(xù)期稍短，為119d，D組在免疫接種后105d平均抗體效價(jià)下降至4log2以下，其抗體有效持續(xù)期僅為63d；C組疫苗免疫接種后22d其平均抗體效價(jià)上升至合格效價(jià)標(biāo)準(zhǔn)以上，并獲得70%以上的群體合格率，其有效持續(xù)時(shí)間達(dá)111d；6個(gè)試驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)抗體效價(jià)變異系數(shù)為0.14～0.93，平均變異系數(shù)為0.26～0.44，效價(jià)整齊度高。對各試驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)的平均抗體效價(jià)進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果顯示，6組疫苗免疫組與空白對照組差異極顯著（P＜0.01）；D組與A組的免疫效果差異顯著（P＜0.05），與B組、E組、F組差異極顯著（P＜0.05）；C組與E組差異顯著（P＜0.05），與F組差異極顯著（P＜0.01）；F組與A組、B組差異顯著（P＜0.05）；其余試驗(yàn)組間免疫效果差異不顯著（P＞0.05）。

表1 H5AIV（Re－6）抗體效價(jià)檢測結(jié)果Table 1 The detection results of antibody titer of H5AIV（Re－6）

表2 H5AIV（Re－6）抗體合格率結(jié)果Table 2 The results of qualified rate of H5AIV（Re－6）antibodies %

圖1 H5AIV（Re－6）抗體效價(jià)曲線圖Fig.1 The curve of H5AIV（Re－6）antibody titer

圖2 H5AIV（Re－6）抗體合格率曲線圖Fig.2 The curve of H5AIV（Re－6）antibody qualified rate

表3 H5AIV（Re－6）抗體效價(jià)變異系數(shù)Table 3 The variation coefficient of H5AIV（Re－6）antibody titers

圖3 免疫接種后不同時(shí)間點(diǎn)H5AIV（Re－6）抗體效價(jià)變異系數(shù)圖Fig.3 The variation coefficient of H5AIV（Re－6）antibody titers at different times

圖4 各試驗(yàn)組 H5AIV（Re－6）抗體效價(jià)變異系數(shù)平均值柱形圖Fig.4 The mean variation coefficient of H5AIV（Re－6）antibody titers in the experimental groups

2.3 試驗(yàn)動物拭子病原學(xué)檢測結(jié)果

試驗(yàn)鴨免疫接種前后各時(shí)間點(diǎn)拭子樣品經(jīng)熒光RT－PCR檢測，H5亞型AIV核酸均為陰性。

3 討論

試驗(yàn)結(jié)果顯示，重組禽流感病毒滅活疫苗（H5N1亞型，Re－6株）對農(nóng)村散養(yǎng)鴨具有良好的臨床安全性，可產(chǎn)生較好的免疫反應(yīng)；不同企業(yè)生產(chǎn)的疫苗免疫效果存在差異，部分企業(yè)生產(chǎn)的疫苗之間差異顯著，且部分差異極顯著。

試驗(yàn)結(jié)果顯示，重組禽流感病毒滅活疫苗（H5N1亞型，Re－6株）對農(nóng)村散養(yǎng)鴨疫苗免疫接種后產(chǎn)生有效免疫保護(hù)（平均抗體效價(jià)≥4log2、群體合格率≥70%）的時(shí)間在免后14d～22d，免疫保護(hù)持續(xù)期最長達(dá)151d以上。

變異系數(shù)常用于反映試驗(yàn)數(shù)據(jù)離散程度。本次試驗(yàn)的6組疫苗，誘導(dǎo)的抗體效價(jià)平均變異系數(shù)均在0.44以下，最低的僅為0.26，表明試驗(yàn)疫苗的免疫效果受個(gè)體差異的影響很小，群體免疫的均一性良好。

禽流感滅活疫苗對水禽進(jìn)行一次免疫接種的免疫效果歷來較差，抗體水平較低，抗體合格持續(xù)期短［9－13］。本次試驗(yàn)所有試驗(yàn)疫苗均進(jìn)行一次免疫接種，除1組疫苗免疫效果較差外，其他組疫苗的免疫效果，在抗體產(chǎn)生速度和合格抗體持續(xù)時(shí)間上，均明顯優(yōu)于以往報(bào)道，其原因可能是疫苗用種毒株Re－6株對鴨的免疫原性優(yōu)于以往的疫苗毒株。

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