梁桂洪,孫 赫,黃宇新,林勇凱,梁祖建
(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院,廣東 廣州 510405;2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬骨傷科醫(yī)院,廣東 廣州 510240)
骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis,OA)是骨傷科臨床上的常見病和多發(fā)病,主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、僵硬、功能障礙,其主要病理特征是關(guān)節(jié)軟骨發(fā)病緩慢,漸進(jìn)性退變,是一種嚴(yán)重影響老年人健康的疾病,其在力學(xué)因素和生物學(xué)因素的共同作用下導(dǎo)致軟骨細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)、軟骨下基質(zhì)3者降解和合成失衡[1]。目前骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制仍不確切[2]。在其病理進(jìn)程中,NO參與了炎癥反應(yīng)。在關(guān)節(jié)軟骨降解中,PGE2是最主要的分解代謝因子之一[3],并參與炎癥反應(yīng)、致痛、影響血管擴(kuò)張及生成,從而產(chǎn)生癥狀。有中醫(yī)學(xué)者認(rèn)為氣滯血淤是OA發(fā)病機(jī)制之一,川芎是一種廣泛應(yīng)用于臨床治療的常用中藥,具有活血行氣、祛風(fēng)止痛的作用,川芎嗪為川芎的主要有效成分,現(xiàn)代研究表明其具有清除氧自由基、鈣拮抗、擴(kuò)血管、抗血小板聚集和血栓形成等多種作用[4]。已有學(xué)者用川芎嗪關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射治療膝骨關(guān)節(jié)炎,長期療效較為可靠[5]。本研究擬通過測定OA大鼠模型膝關(guān)節(jié)液中NO、PGE2的含量,探討川芎嗪在減緩OA炎癥的發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制,為臨床上治療OA提供理論依據(jù)。
1.1.1 實(shí)驗動物 SPF級健康雌性SD大鼠24只,體重180g~220g,由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗動物中心提供。
1.1.2 主要試劑 NO、PGE2試劑盒,廣州齊云生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。
1.1.3 藥物制備 鹽酸川芎嗪注射液20mg/mL,無錫市第七制藥有限公司產(chǎn)品(批號:H32023383),參照臨床,劑量為每天7.19mg/kg,采用關(guān)節(jié)腔注射;氯化鈉注射液,上海華原股份有限公司產(chǎn)品。
1.2.1 分組與造模 將動物隨機(jī)分為假手術(shù)組、OA模型空白組、川芎嗪組,每組8只,用100g/L水合氯醛溶液按3.5mL/kg腹腔注射,5min后完全麻醉,OA模型空白組和川芎嗪組經(jīng)背部切口切除大鼠雙側(cè)卵巢,切斷右膝內(nèi)側(cè)副韌帶及交叉韌帶,行抽屜試驗陽性后徹底止血,逐層縫合;假手術(shù)組經(jīng)背部切口將大鼠卵巢從腹腔提出,僅切除卵巢周圍少量脂肪,不切除卵巢,切開右膝關(guān)節(jié)處皮膚,不做其他處理后即縫合。所有傷口在縫合前均滴入少量的青霉素溶液。術(shù)后連續(xù)4d肌肉注射青霉素4萬單位/d。第5天起每天驅(qū)趕動物奔跑30min,其余時間任其籠內(nèi)自由活動。
1.2.2 治療方法 術(shù)后4周開始每次給川芎嗪組關(guān)節(jié)腔注射鹽酸川芎嗪注射液0.36mL/kg。OA模型空白組、假手術(shù)組關(guān)節(jié)腔注射等量的生理鹽水,每周2次,連續(xù)注射4周。
1.2.3 飼養(yǎng)環(huán)境 術(shù)后分籠飼養(yǎng),所有SD大鼠均喂養(yǎng)在恒溫、恒濕的清潔環(huán)境中,環(huán)境溫度為25℃±1℃,濕度為68%,每天12h光照/黑暗,任意進(jìn)食飼養(yǎng)者提供的大鼠標(biāo)準(zhǔn)飼料和自來水。
1.2.4 觀察指標(biāo) 各組于術(shù)后第4、8周抽取各組關(guān)節(jié)液進(jìn)行NO、PGE2含量測定。
1.2.5 指標(biāo)檢測方法 NO、PGE2檢測,參照試劑盒方法進(jìn)行操作。
1.2.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±SD)表示,多組比較符合正態(tài)性和方差齊性用方差分析,不符合正態(tài)性或方差齊性用非參數(shù)檢驗;計數(shù)資料以率或構(gòu)成比表示,采用X2檢驗;等級資料采用非參數(shù)秩和檢驗。所有統(tǒng)計檢驗均采用雙側(cè)檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
術(shù)后4周,OA模型空白組與川芎嗪組關(guān)節(jié)液中的NO較假手術(shù)組明顯升高(P<0.01),OA模型空白組關(guān)節(jié)液中的NO與川芎嗪組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.10);術(shù)后8周OA模型空白組關(guān)節(jié)液中的NO較假手術(shù)組明顯升高(P<0.01);術(shù)后8周川芎嗪組關(guān)節(jié)液中的NO較術(shù)后4周明顯減少(P<0.01);術(shù)后8周川芎嗪組關(guān)節(jié)液中的NO較OA模型空白組明顯減少(P<0.05);術(shù)后8周川芎嗪組關(guān)節(jié)液中的NO與假手術(shù)組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.10)(表1)。
術(shù)后4周,OA模型空白組與川芎嗪組關(guān)節(jié)液中的PGE2較假手術(shù)組明顯升高(P<0.01);OA模型空白組關(guān)節(jié)液中的PGE2與川芎嗪組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.10);術(shù)后8周PGE2模型空白組關(guān)節(jié)液中的PGE2較假手術(shù)組明顯升高(P<0.01);術(shù)后8周川芎嗪組關(guān)節(jié)液中的PGE2較術(shù)后4周明顯減少(P<0.01);術(shù)后8周川芎嗪組關(guān)節(jié)液中的PGE2較OA模型空白組明顯減少(P<0.05);術(shù)后8周川芎嗪組關(guān)節(jié)液中的PGE2與假手術(shù)組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.10)(表2)。
表1 術(shù)后4周、8周關(guān)節(jié)液中的NO含量測定Table1 Determination of NO content in the fluid within joints after operation 4weeks and 8weeks μmol/L
表2 術(shù)后4周、8周關(guān)節(jié)液中的PGE2含量測定Table2 Determination of PGE2content in the fluid within joints after operation 4weeks and 8weeks μmol/L
據(jù)世界衛(wèi)生組織調(diào)查[6],骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病人口已達(dá)10%左右,其發(fā)病率和年齡成正相關(guān)。OA的發(fā)病機(jī)理非常復(fù)雜,至少遠(yuǎn)未達(dá)到可以研究清楚的程度,而滑膜炎癥與關(guān)節(jié)退變在本病的發(fā)生發(fā)展過程中占有重要的地位。研究表明OA發(fā)生時,各種細(xì)胞因子及軟骨降解產(chǎn)物的強(qiáng)烈刺激使NO水平升高,而過多的NO不但可協(xié)同其他細(xì)胞因子增加軟骨損害,而且可增強(qiáng)基質(zhì)金屬蛋白酶的活性,促進(jìn)軟骨蛋白聚糖和膠原的裂解[7]。NO的大量釋放又進(jìn)一步促進(jìn)炎性細(xì)胞因子釋放,從而抑制軟骨細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì),影響Ⅱ型膠原合成[8],最終導(dǎo)致軟骨的質(zhì)量因營養(yǎng)障礙,不斷下降和進(jìn)行性退化。反之,NO還可促進(jìn)IL-1介導(dǎo)軟骨降解作用,減少軟骨細(xì)胞合成IL-1Ra,影響基質(zhì)生物合成。而且NO在滑膜炎的形成中也起著重要的作用,滑膜中高含量的NO可引起滑膜組織的損傷和血管擴(kuò)張、血管壁的通透性增大而引起滲出,導(dǎo)致滑膜腫脹、充血及關(guān)節(jié)內(nèi)的粒細(xì)胞滲出,形成關(guān)節(jié)積液,從而引起關(guān)節(jié)的腫脹、疼痛。另外,NO還可導(dǎo)致軟骨細(xì)胞發(fā)生凋亡[9]。PGE2是由活化磷脂酶 A2 (phospholipase A2,PLA2)分解膜磷脂產(chǎn)生花生四烯酸氨基酸,在環(huán)氧化酶(cyclooxygenase,COX)和前列腺素E合成酶(prostaglandin E synthase,PGES)作用下形成的。炎性介質(zhì)IL-1和TNF-α能誘導(dǎo)和激活PLA2,活化花生四烯酸代謝途徑,促使PGE2合成增加。PGE2還可舒張小血管,增加微循環(huán)通透性.增加滲出與水腫,誘導(dǎo)白細(xì)胞聚集,加重滑膜炎癥反應(yīng),并參與軟骨下骨重塑[10],PGE2又可進(jìn)一步加強(qiáng)IL-1對軟骨的分解作用,使滑膜細(xì)胞與浸潤性炎性細(xì)胞反應(yīng)性增強(qiáng)。同時PGE2通過細(xì)胞間環(huán)腺苷酸積累,直接誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡,增加破骨細(xì)胞形成,促進(jìn)骨吸收。有研究表明,臨床上可以通過抽取并檢測膝關(guān)節(jié)液中MMP-3和PGE2的含量,作為早期診斷OA的重要指標(biāo)[11]。由此可見,NO、PGE2對OA疾病發(fā)生發(fā)展及病理過程具有重要的影響。
川芎是一種廣泛應(yīng)用于臨床治療的常用中藥,具有活血行氣、祛風(fēng)止痛的作用,被譽(yù)為血中之氣藥。川芎嗪來源于傘形科植物川芎(Ligusticum wallichii)的干燥根莖,其化學(xué)結(jié)構(gòu)為四甲基吡嗪,具有典型的鈣離子拮抗劑的特性。研究表明川芎嗪有解痙、強(qiáng)烈抑制血小板凝集、擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)、降低全血黏度、改善血液流變學(xué)、清除自由基、抑制細(xì)胞凋亡、抗炎消腫、降低心肌耗氧等多種作用[4]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為OA的病因與骨內(nèi)靜脈淤滯、骨內(nèi)高壓有密切聯(lián)系,活血化瘀類藥物具有改善骨內(nèi)血液流變學(xué)和血流動力學(xué)狀態(tài),降低骨內(nèi)高壓,改善骨內(nèi)微循環(huán)的作用,能從根本上治療本病??赂叻宓萚12]通過比較活血法、溫經(jīng)法、補(bǔ)肝腎法和活血溫經(jīng)補(bǔ)肝腎法對膝骨關(guān)節(jié)炎滑膜中NO、TL-6濃度的影響,發(fā)現(xiàn)活血藥更能抑制OA早期模型滑膜中NO、TL-6的濃度,更能緩解關(guān)節(jié)炎發(fā)展,對于緩解骨關(guān)節(jié)炎的臨床癥狀的效果更好。而且川芎嗪治療OA的臨床與試驗研究已有相關(guān)報道。王文瑞等[13]觀察了川芎嗪對膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎軟骨退變的保護(hù)作用,發(fā)現(xiàn)川芎嗪改善了關(guān)節(jié)周圍組織的血液淤滯狀態(tài),使血流暢通,局部組織的理化環(huán)境恢復(fù)正常,提高關(guān)節(jié)軟骨SOD活性,糾正了氧自由基代謝紊亂。王鎖良等[14]通過比較激素類藥物以及川芎嗪關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射對骨關(guān)節(jié)炎過程中軟骨退變的作用,發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射川芎嗪能減輕兔膝關(guān)節(jié)炎模型的關(guān)節(jié)軟骨退變程度,并可促進(jìn)軟骨的自身修復(fù)。何建新等[15]通過試驗研究表明川芎嗪可通過刺激TIMP-1的合成,降低軟骨基質(zhì)中 MMP-13mRNA表達(dá),延緩了軟骨細(xì)胞的退變和基質(zhì)的降解,從而起到了防治骨性關(guān)節(jié)炎的作用。洪昆達(dá)[16]通過研究發(fā)現(xiàn),關(guān)節(jié)腔注射川芎嗪后可能是通過調(diào)節(jié)機(jī)體炎癥因子的表達(dá),以及促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖與抑制軟骨細(xì)胞調(diào)亡,起到保護(hù)軟骨的作用,從而有效地緩解了疲血阻絡(luò)型膝骨性關(guān)節(jié)炎患者的臨床癥狀。張卓等[17]通過研究發(fā)現(xiàn)川芎嗪可能是通過抑制了MMPs的活性,抑制軟骨基質(zhì)中蛋白多糖的丟失過程,從而起到抑制關(guān)節(jié)退變的作用。為此,本研究選用了川芎嗪作為治療藥物。
本試驗研究結(jié)果顯示,術(shù)后8周,關(guān)節(jié)液中NO、PGE2的水平在川芎嗪組中表達(dá)均較OA模型空白組及術(shù)后第4周川芎嗪組明顯減弱(P<0.05,P<0.01);OA模型空白組及川芎嗪組關(guān)節(jié)液中的NO、PGE2均較假手術(shù)組明顯升高(P<0.01);術(shù)后8周川芎嗪組關(guān)節(jié)液中的NO、PGE2與假手術(shù)組比較均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.10)。因此,我們推測川芎嗪能通過抑制NO、PGE2的生成從而緩解了OA炎癥的發(fā)展,對OA起到抗炎、鎮(zhèn)痛的防治作用。綜上所述,關(guān)節(jié)腔注射川芎嗪治療OA效果可靠,操作簡便,值得臨床推廣應(yīng)用。有關(guān)劑量效應(yīng)關(guān)系和時間效應(yīng)關(guān)系的對照研究、動態(tài)的觀察川芎嗪對OA炎癥發(fā)生發(fā)展進(jìn)展的影響和最佳治療劑量,有待于進(jìn)一步研究。
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