劉 靜，鄭增忍，趙思俊，曲志娜，王君瑋，孫曉亮，譚維泉，劉 坤，曹旭敏，鄒 明

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東青島266109；2.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島266032）

青霉素G（penicillin G）屬于β－內(nèi)酰胺類抗生素，價(jià)格低廉，療效顯著，常用于治療奶牛乳腺炎、子宮內(nèi)膜炎等常見(jiàn)奶牛疾病。然而藥物的不合理使用會(huì)在牛奶中造成殘留，青霉素G化學(xué)結(jié)構(gòu)中的β－內(nèi)酰胺環(huán)不穩(wěn)定，容易發(fā)生酶解，產(chǎn)生以青霉噻唑酸為主的代謝產(chǎn)物。牛奶中殘留的青霉素G或青霉噻唑酸會(huì)成為青霉素過(guò)敏患者的過(guò)敏原，引起患者的過(guò)敏反應(yīng)，甚至造成過(guò)敏性休克危及患者生命安全［1］。為保護(hù)消費(fèi)者的安全，食品法典委員會(huì)、歐盟、美國(guó)和我國(guó)農(nóng)業(yè)部等均對(duì)牛奶中青霉素G的最高殘留限量（maximum residue limits，MRLs）為4μg／kg，青霉噻唑酸的 MRLs尚未規(guī)定［2］。建立青霉素G及代謝產(chǎn)物快速而靈敏的檢測(cè)方法，對(duì)保護(hù)消費(fèi)者安全具有重要意義。

動(dòng)物性食品中β－內(nèi)酰胺類抗生素殘留的檢測(cè)方法已有報(bào)道［3－5］，但同時(shí)對(duì)青霉素G和青霉噻唑酸進(jìn)行研究的報(bào)道較少。Kress C等［6］研究了酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定羊奶中的青霉噻唑酸，該方法適用于樣品的大量篩選，不適用于確證檢測(cè)。陳聰?shù)龋?］研究了測(cè)定血漿中青霉素G及代謝物的超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法，研究了青霉素G及代謝產(chǎn)物的消除規(guī)律。劉創(chuàng)基等［8］研究了超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定牛肉中青霉素類藥物及代謝產(chǎn)物殘留的方法，采用乙腈勻漿提取，正己烷去脂的方法，樣品處理過(guò)程復(fù)雜。馮月超等［9］建立了牛奶中青霉素G和青霉噻唑酸的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，藥物回收率為92%～103%，青霉素G的定量限5 μg／kg，超過(guò)了國(guó)家對(duì)牛奶中青霉素 G的規(guī)定MRLs，且該方法未消除牛奶基質(zhì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。本試驗(yàn)在此基礎(chǔ)上采用超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC－MS／MS）對(duì)牛奶中青霉素G及青霉噻唑酸同時(shí)進(jìn)行測(cè)定，優(yōu)化樣品的前處理方法，對(duì)基質(zhì)效應(yīng)的影響進(jìn)行研究和消除，為快速準(zhǔn)確的檢測(cè)該類藥物提供可靠的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主 要 儀 器 設(shè) 備 AcquityTMUPLC－Xevo TQMS超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜儀、Oasis HLB固相萃取柱，美國(guó) Waters公司產(chǎn)品；N2蒸發(fā)儀，美國(guó)Organomation Associates公司產(chǎn)品；QL－866型漩渦混合器，海門其林貝爾儀器制造有限公司產(chǎn)品；J2－21型高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Backman公司產(chǎn)品；HY－5型回旋振蕩器，常州國(guó)華電器有限公司產(chǎn)品；Q－純水儀，美國(guó)Millipore公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要試劑 青霉素 G（penicillin G，純度99.5%），德國(guó) Dr.Ehrenstorfer公司產(chǎn)品；青霉噻唑酸（benzylpenicillin acid純度98.6%），英國(guó)LGC公司產(chǎn)品；甲醇、甲酸、乙腈（色譜純），德國(guó) Merck公司產(chǎn)品；高純水（Millipore，17.9MΩ·cm）、乙醇、甲酸銨（分析純），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配置，即準(zhǔn)確稱取青霉素G及青霉噻唑酸標(biāo)準(zhǔn)品到10mL棕色容量瓶中，分別用500mL／L乙腈水溶解并定容，配成1 000μg／mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置－20℃冷藏保存。臨用前用500mL／L乙腈水稀釋至工作濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2 UPLC－MS／MS條件

1.2.2.1 色譜條件 色譜柱為 Waters Acquity UPLC BEH C18柱（100mm ×2.1mm，1.7μm ），流動(dòng)相A為1mL／L甲酸溶液，B為乙腈溶液，進(jìn)樣量5μL，柱溫35℃，流速0.3mL／min，梯度洗脫程序如表1所示。

1.2.2.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI＋），正離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式，毛細(xì)管電壓：2.5kV；離子源溫度150℃，霧化器流1 000L／h，錐孔氣流50L／h，霧化室溫度500℃（表2）。

表1 分離青霉素G及青霉噻唑酸的梯度洗脫程序Table 1 The gradient elution of penicillin G and benzylpenicillin acid

表2 青霉素G及其青霉噻唑酸的質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)Table 2 The mass spectrum detection parameters of penicillin G and benzylpenicillin acid

1.2.3 牛奶樣品的前處理

1.2.3.1 提取 取空白牛奶加標(biāo)樣品2mL于50mL離心管中，加入6mL乙腈∶乙醇（3∶1，V∶V）的混合溶液，渦旋混勻，振蕩提取20min，以10 000r／min離心5min，上清液轉(zhuǎn)移潔凈試管內(nèi)，50℃ 下 N2吹干，用3mL 0.01mol／L 甲酸銨（pH8.5）溶解，待用。

1.2.3.2 凈化 將溶液加入到用3mL甲醇活化，3mL水和3mL 0.01mol／L甲酸銨（pH8.5）平衡的HLB固相萃取柱中，依次用2mL 0.01mol／L甲酸銨（pH8.5）和1mL水淋洗，抽干，經(jīng)3mL乙腈洗脫后，收集洗脫液，50℃下N2吹干。殘余物用1mL 200mL／L乙腈水復(fù)溶，過(guò)0.2μm濾膜，供 UPLCMS／MS測(cè)定。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

1.2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)品直接稀釋 用200mL／L乙腈水稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，制備系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行UPLC－MS／MS分析，以定量離子的峰面積為縱坐標(biāo)（y），標(biāo)準(zhǔn)品添加濃度為橫坐標(biāo)（x）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

1.2.4.2 基質(zhì)添加校正曲線 取2mL空白牛奶于50mL離心管中，按照1.2.3方法進(jìn)行處理，用200 mL／L乙腈水復(fù)溶后稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，制備系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行UPLC－MS／MS分析，以定量離子的峰面積為縱坐標(biāo)（y），標(biāo)準(zhǔn)品添加濃度為橫坐標(biāo)（x）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

1.2.5 基質(zhì)效應(yīng)的測(cè)定 本研究按照Matuszewski B K等［10］提出的方法評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)的大小。青霉素G及青霉噻唑酸標(biāo)準(zhǔn)品用200mL／L乙腈水直接稀釋后測(cè)得的峰面積為S1?？瞻着Ｄ贪凑?.2.3方法處理，用200mL／L乙腈水復(fù)溶后稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)得的峰面積為S2，則基質(zhì)效應(yīng)ME%＝S2／S1×100%。本試驗(yàn)選取5、10、20、50、100μg／kg等濃度對(duì)基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行測(cè)定。

1.2.6 基質(zhì)效應(yīng)的消除 按照1.2.4.2方法制備基質(zhì)添加校正曲線，并求出回歸方程，對(duì)試驗(yàn)檢測(cè)樣品的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行校正。

1.2.7 穩(wěn)定性研究 取空白牛奶按照1.2.3方法處理，200mL／L乙腈水復(fù)溶，青霉素G和青霉噻唑酸添加4μg／kg標(biāo)準(zhǔn)品（青霉噻唑酸MRL未規(guī)定，添加濃度同青霉素G），做6個(gè)平行，置于4℃和室溫（20℃～25℃）環(huán)境下0、24、48h后，進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.8 實(shí)際樣品測(cè)定 購(gòu)買市場(chǎng)上的20份牛奶按照1.2.3方法處理，用200mL／L乙腈水復(fù)溶，過(guò)膜后上機(jī)檢測(cè)，對(duì)樣品中的青霉素G和青霉噻唑酸的含量進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1 線性范圍與檢測(cè)限

空白牛奶按照1.2.3方法處理，用200mL／L乙腈水復(fù)溶后稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，制備系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，定量離子的峰面積為縱坐標(biāo)（y），標(biāo)準(zhǔn)品添加濃度為橫坐標(biāo)（x）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果顯示相關(guān)系數(shù)均大于0.99，線性良好。

空白牛奶添加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，渦旋混勻，室溫放置10min，按照1.2.3方法進(jìn)行處理，UPLC－MS／MS測(cè)定，信噪比為3h和10h對(duì)應(yīng)的濃度分別為檢測(cè)限和定量限（表3）。本方法靈敏度高、線性良好、能夠滿足食品中獸藥殘留分析的要求。

表3 方法的線性范圍和檢測(cè)限Table 3 Linearity range and detection limits for penicillin G and benzylpenicillin acid

2.2 基質(zhì)效應(yīng)的大小

本研究按照Matuszewski B K等［10］提出的方法評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)的大小。當(dāng)ME＝100%時(shí)，表明不存在基質(zhì)效應(yīng)；當(dāng)ME＞100%時(shí)，表明樣品基質(zhì)對(duì)分析物的檢測(cè)結(jié)果有增強(qiáng)作用；當(dāng) ME＜100%時(shí)，表明樣品基質(zhì)對(duì)分析物的檢測(cè)結(jié)果有抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在檢測(cè)范圍內(nèi)，青霉素G和青霉噻唑酸的ME分別為91.02%～96.08%、91.93%～97.67%，表明基質(zhì)對(duì)青霉素G和青霉噻唑酸存在不同程度的抑制作用，相同添加濃度下對(duì)青霉素G的抑制作用稍強(qiáng)于青霉噻唑酸，且藥物濃度越低，基質(zhì)效應(yīng)的影響越大（圖1）。生物組織中藥物的殘留濃度一般較低，多為痕量檢測(cè)，因此在檢測(cè)過(guò)程中需要考慮基質(zhì)效應(yīng)對(duì)結(jié)果的影響。

圖1 基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果Fig.1 Matrix effect results

2.3 方法的回收率和精密度

用空白牛奶樣品在低、中、高3個(gè)水平進(jìn)行加標(biāo)回收和精密度試驗(yàn)，樣品添加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，渦旋混勻，靜置10min，按照1.2.3進(jìn)行處理，UPLC－MS／MS進(jìn)行檢測(cè)，基質(zhì)添加曲線進(jìn)行校正，其回收率和精密度結(jié)果見(jiàn)表4。樣品的加標(biāo)回收率為75.88%～106.01%，變異系數(shù)為6.65%～14.17%，符合獸藥殘留分析的要求。

2.4 穩(wěn)定性研究

以初次檢測(cè)的平均色譜峰面積為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算不同溫度下間隔一定時(shí)間后的藥物含量回收率。試驗(yàn)結(jié)果顯示，在4℃環(huán)境中，間隔24h和48h后青霉素G的回收率分別為96.97%和90.31%，青霉噻唑酸的回收率分別為91.63%和84.69%。在室溫條件下，青霉素G的回收率分別為88.76%和86.98%，青霉噻唑酸的回收率分別為84.12%和85.51%。結(jié)果表明兩種化合物均會(huì)隨放置時(shí)間的增長(zhǎng)而發(fā)生降解，且室溫條件下降解速度較快，所以樣品處理后的保存需要考慮溫度的影響。現(xiàn)實(shí)中經(jīng)常遇到不能立即檢測(cè)現(xiàn)象，本方法的靈敏度低，MRL濃度的樣品處理后，4℃保存48h，仍在本方法檢測(cè)范圍之內(nèi)，可提供一定程度的靈活性，但試驗(yàn)結(jié)果的檢測(cè)濃度會(huì)受到一定影響，所以樣品處理后應(yīng)盡快檢測(cè)，獲得最準(zhǔn)確可靠的結(jié)果。

表4 方法的加標(biāo)回收率和精密度Table 4 Recoveries and RSDs for penicillin G and benzylpenicillin acid

2.5 實(shí)際樣品測(cè)定

本試驗(yàn)方法對(duì)購(gòu)買的20份牛奶樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果顯示。所購(gòu)牛奶中均不含青霉素G及青霉噻唑酸殘留。

3 討論

3.1 UPLC－MS／MS的優(yōu)化

用200mL／L乙腈水分別配制濃度為1μg／mL的青霉素G和青霉噻唑酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。在電噴霧正離子模式（ESI＋）下進(jìn)行全掃描，觀察MSTune界面的［M＋H］＋峰的響應(yīng)強(qiáng)度，選擇豐度較大的分子離子峰作為母離子，然后對(duì)其進(jìn)行子離子掃描（Daughter Scan），獲得碎片離子峰，從中選擇響應(yīng)較強(qiáng)的一對(duì)離子，其中較高的作為定性離子。對(duì)其質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化后，獲得的質(zhì)譜條件見(jiàn)表2。

在色譜分析中，流動(dòng)相中的有機(jī)相多選擇甲醇或乙腈［5，7－8］，但甲醇含有羥基，可能與青霉素類藥物發(fā)生醇解，故本試驗(yàn)選擇乙腈為有機(jī)相。采用正離子模式進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)時(shí)，流動(dòng)相中添加甲酸有助于分析物的質(zhì)子化，而pH太低，則可能對(duì)藥物的保留和穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。故本試驗(yàn)參考相關(guān)文獻(xiàn)［8－9，14］，流動(dòng)相選用1mL／L甲酸水和乙腈，梯度洗脫進(jìn)行分離，色譜條件見(jiàn)表1。圖2為最優(yōu)條件下青霉素G和青霉噻唑酸標(biāo)準(zhǔn)品10μg／kg的色譜圖。圖中可以看出優(yōu)化條件后，目標(biāo)物質(zhì)質(zhì)譜響應(yīng)高，峰形理想，達(dá)到試驗(yàn)檢測(cè)的要求。

3.2 樣品前處理方法的優(yōu)化

牛奶樣品前處理通常會(huì)有除蛋白及除脂肪兩個(gè)關(guān)鍵步驟，提取青霉素類藥物的常用提取溶劑有乙腈［11］、酸化乙腈、乙醇等［11－13］，個(gè)別文獻(xiàn)采用無(wú)機(jī)溶劑如乙酸鋅－亞鐵氰化鉀，乙酸鉛－草酸鉀－磷酸氫二鈉等［14］，由于β－內(nèi)酰胺環(huán)不穩(wěn)定，可能會(huì)使目標(biāo)化合物分解。因此本試驗(yàn)選擇了乙腈、乙醇及不同比例（V∶V，3∶1，1∶1）的乙腈－乙醇混合溶液進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果顯示相同的用量時(shí)，乙醇和乙腈－乙醇（V∶V，1∶1）的沉淀效果不理想，相同用量條件下，乙腈－乙醇（3∶1，V∶V）混合溶液可以獲得理想的沉淀效果和回收效率，且減少了乙腈的用量，所以本試驗(yàn)選用乙腈－乙醇（3∶1，V∶V）混合溶液作為提取液。

參考有關(guān)文獻(xiàn)［8，12］對(duì)青霉素G和青霉噻唑酸的處理方法中，多采用提取液沉淀蛋白，冷凍高速離心去除脂肪的方法。Liu C J等［13］建立牛奶中青霉素及代謝產(chǎn)物的UPLC－MS／MS檢測(cè)法，牛奶離心后選用乙醇進(jìn)行提取，離心后上清液旋轉(zhuǎn)蒸干，添加氯化鈉防止爆沸，乙酸銨溶解后再次進(jìn)行高速離心，上清液過(guò)膜后進(jìn)行檢測(cè)。由于Acquity UPLC色譜柱的填料粒徑小、柱體積小、柱壓高，所以對(duì)樣品的凈化效果也有更高的要求，上述試驗(yàn)方法中使用氯化鈉，可能隨樣品溶液進(jìn)入色譜柱，對(duì)色譜柱的正常使用造成影響，且該方法樣品的處理過(guò)程復(fù)雜。相關(guān)文獻(xiàn)［14－15］中，Oasis HLB 柱常被用于β－內(nèi)酰胺類藥物提取液的凈化，在樣品上樣前用pH8.5的0.05 mol／L磷酸緩沖液對(duì)Oasis HLB進(jìn)行平衡。本試驗(yàn)用Oasis HLB柱對(duì)提取溶液進(jìn)行凈化，用甲酸銨代替磷酸鹽對(duì)Oasis HLB柱進(jìn)行平衡，對(duì)甲酸銨的濃度和pH進(jìn)行優(yōu)化篩選，試驗(yàn)結(jié)果顯示甲酸銨溶液的濃度為0.01mol／L，pH8.5時(shí)，青霉素 G 和青霉噻唑酸的回收率高于75.88%，滿足試驗(yàn)要求。甲酸銨為揮發(fā)性鹽，不存在堵塞色譜柱的問(wèn)題，避免了影響儀器正常使用的風(fēng)險(xiǎn)。因此本試驗(yàn)采用乙腈－乙醇混合溶液（V∶V，3∶1）提取牛奶中的青霉素G和青霉噻唑酸后，選用Oasis HLB進(jìn)行凈化，提取凈化步驟簡(jiǎn)單，藥物回收率達(dá)到75.88%～106.01%，試驗(yàn)結(jié)果理想。

3.3 基質(zhì)效應(yīng)的消除

牛奶基質(zhì)成分復(fù)雜，選用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，尤其是電噴霧離子源用來(lái)分析殘留藥物，往往會(huì)發(fā)生干擾物質(zhì)產(chǎn)生離子增強(qiáng)或者抑制的現(xiàn)象，故在方法驗(yàn)證階段必須進(jìn)行基質(zhì)效應(yīng)的考察。內(nèi)標(biāo)法和基質(zhì)校正添加曲線法定量，都能極大的消除基質(zhì)效應(yīng)的影響，在消除基質(zhì)效應(yīng)的研究中都有較多應(yīng)用［15－17］，但內(nèi)標(biāo)法需要使用內(nèi)標(biāo)化合物，最好是氘代標(biāo)記化合物，氘代標(biāo)記化合物價(jià)格昂貴，難以獲取。因此，本研究選用基質(zhì)添加校正曲線法消除基質(zhì)效應(yīng)，進(jìn)行定量。此方法操作簡(jiǎn)單，節(jié)約成本，且試驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定，校正后樣品加標(biāo)回收率為75.88%～106.01%，變異系數(shù)為6.65%～14.17%，試驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性與精密度較為理想，滿足試驗(yàn)要求。

本研究采用超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC－MS／MS），通過(guò)對(duì)樣品提取、凈化等條件的優(yōu)化，選用基質(zhì)校正添加曲線法進(jìn)行定量，建立了一種簡(jiǎn)單、快速的青霉素G和青霉噻唑酸殘留的檢測(cè)方法，此方法靈敏度高、線性范圍好、回收率和重現(xiàn)性好，能滿足獸藥殘留檢測(cè)的要求，可為快速準(zhǔn)確的檢測(cè)該類藥物提供可靠的技術(shù)支撐。

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