金 雁, 劉 瑜, 李曉東, 趙 穎, 蔣 施, 鐘 鈺, 鄭 晨

(1. 沈陽出入境檢驗(yàn)檢疫局, 沈陽 110016;2. 上海愛博才思分析儀器貿(mào)易有限公司, 上海 200233)

金 雁1, 劉 瑜1, 李曉東1, 趙 穎1, 蔣 施1, 鐘 鈺1, 鄭 晨2

(1. 沈陽出入境檢驗(yàn)檢疫局, 沈陽 110016;2. 上海愛博才思分析儀器貿(mào)易有限公司, 上海 200233)

建立水產(chǎn)品中獸藥的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜復(fù)合線性離子阱系統(tǒng)EPI掃描方式的數(shù)據(jù)庫及篩查分析方法。7種獸藥的最低檢出限(LOD,S/N≥3)5 μg/kg,最低定量限(LOQ,S/N≥10)10 μg/kg。每種獸藥添加10 μg/kg、50 μg/kg、100 μg/kg 3個(gè)水平到空白基質(zhì)中(n=6),回收率為83.2%～105.8%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為4.9%～10.2%。方法除兩對離子對、保留時(shí)間外,利用子離子比對進(jìn)行化合物的真?zhèn)舞b定,可以有效的排除假陽性。數(shù)據(jù)庫建立過程簡單快捷,借助離子阱的富集功能,實(shí)現(xiàn)對水產(chǎn)品樣本中多種獸藥殘留的定性定量分析,且具有靈敏、準(zhǔn)確的特點(diǎn)。

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜復(fù)合線性離子阱; 數(shù)據(jù)庫; 獸藥篩查; 水產(chǎn)品

0 引 言

我國是水產(chǎn)品的養(yǎng)殖大國和出口大國,為了防治水生動(dòng)物疾病、增加運(yùn)輸過程中的成活率、促進(jìn)生長、提高經(jīng)濟(jì)效益,各類獸藥被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中。但由于獸藥在使用過程中存在濫用、誤用及不遵守休藥期等現(xiàn)象,其副作用體現(xiàn)的越來越明顯,集中表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面:1)耐藥菌株的產(chǎn)生;2)在水產(chǎn)品中產(chǎn)生藥物殘留;3)破壞微生態(tài)平衡;4)對免疫系統(tǒng)有抑制作用。其中因?yàn)樵谏镦滍敹说娜祟愰L期食用藥物殘留的水產(chǎn)品將會產(chǎn)生耐藥性甚至導(dǎo)致多種疾病,所以在水產(chǎn)品中產(chǎn)生的藥物殘留最為引起人們的關(guān)注。許多國家及國際組織對水產(chǎn)品中的獸藥殘留制定了最大允許殘留限量( MRLs)[1-3],以保證水產(chǎn)品的安全衛(wèi)生,進(jìn)而維護(hù)水產(chǎn)品的食用安全。

目前,監(jiān)控多種獸藥的方法有很多種,如微生物檢測法[4-5],液相色譜法[6],氣相色譜法[7],分子印跡膜法[8],氣相色譜質(zhì)譜法[9],液相色譜質(zhì)譜法[10-13],其中以液相色譜質(zhì)譜法最為常見。氯霉素、氟苯尼考以及糖皮質(zhì)激素類藥物均有可供參考的國家標(biāo)準(zhǔn)[14-16],雖然有很多研究報(bào)告發(fā)表[17-18],但是由于水產(chǎn)品樣本容易出現(xiàn)假陽性的特點(diǎn),并且沒有專門針對多種負(fù)離子化合物的實(shí)驗(yàn)方法。本研究應(yīng)用液相色譜-三重四極桿/線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜法(QTrap LC-MS/MS)檢測,具有從多級反應(yīng)監(jiān)測( MRM)→信息相關(guān)采集( IDA)→增強(qiáng)子離子掃描( EPI)→譜庫檢索的獨(dú)有檢測模式,開發(fā)針對負(fù)離子化合物數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建方法。通過構(gòu)建這些化合物的標(biāo)準(zhǔn)譜庫,利用與標(biāo)準(zhǔn)譜庫對比的方法鑒定陽性樣品,提高方法的準(zhǔn)確性。本研究針對水產(chǎn)品養(yǎng)殖中常用的抗生素及激素類藥物,建立了氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、己烯雌酚、雙烯雌酚、雌酮、地塞米松的LC-MS/MS譜庫,并利用譜庫檢索建立水產(chǎn)品中7種藥物的快速LC-MS/MS篩查方法。該方法對保障我國水產(chǎn)品的質(zhì)量安全具有重要意義。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑

ACQUITYTM超高效液相色譜儀(美國Waters公司);AB Sciex Qtrap 5500三重四極桿-線性加速離子阱復(fù)合質(zhì)譜儀(美國AB公司);Millipore-Elix-QE-QG超純水機(jī)(美國Millipore公司);離心機(jī)(美國Thermo公司);MG-2200氮吹儀(美國EYELA公司);CPA 225D分析天平(德國Sartorius公司)等實(shí)驗(yàn)室常用設(shè)備。

氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、己烯雌酚、雙烯雌酚、雌酮、地塞米松標(biāo)準(zhǔn)品,購于Dr.Ehrenstorfer 公司;乙腈、甲醇為色譜純,水為超純水;冰醋酸、無水硫酸鈉、氯化鈉均為分析純;C18( 天津Bonna-Agela 公司) 。標(biāo)準(zhǔn)品用少量乙腈溶解,色譜純乙腈定容配制1 mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)儲備液,再根據(jù)需要稀釋成適當(dāng)含量的標(biāo)準(zhǔn)工作液,4 ℃下保存,有效期為2 個(gè)月。

1.2色譜條件

Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1×100 mm,粒徑1.7 μm),柱溫40 ℃,進(jìn)樣量5 μL,流速0.3 mL/min。流動(dòng)相A為超純水,B相為乙腈。起始B相為5%乙腈,1 min～10 min B相梯度變化到40%,10 min～15 min B相梯度變化為95%,15 min～18 min B相維持95%,18 min～18.1 min B相梯度變化為5%,保持5 min。

1.3質(zhì)譜條件

離子源:ESI-;噴霧電壓(IS)-4 500 V,霧化氣(GS1)50 mL/min,氣簾氣(CUR)30 mL/min,輔助加熱氣(GS2)60 L/min,離子源溫度(TEM)600 ℃,碰撞氣5 mL/min,4 種氣體均為氮?dú)?Q1和Q3均為單位分辨率;ESI模式、去簇電壓(DP)和碰撞能量(CE)見表1。

表1 7種化合物的最佳質(zhì)譜參數(shù)

1.4數(shù)據(jù)庫構(gòu)建

本實(shí)驗(yàn)中一共建立了2個(gè)數(shù)據(jù)庫,一個(gè)是以化合物質(zhì)譜圖為檢索信息的譜圖數(shù)據(jù)庫,一個(gè)是基于化合物保留時(shí)間的文本數(shù)據(jù)庫。數(shù)據(jù)采集時(shí),以氟苯尼考為例,濃度10 ng/mL,保留時(shí)間6.4 min,保留時(shí)間窗口60 s。其中譜圖數(shù)據(jù)庫的建立過程是分別設(shè)定20、35、50 eV的碰撞能量以及CE為35 eV,CES為15 eV的擴(kuò)展能量,采集這4張質(zhì)譜圖用于化合物的匹配。對7種藥物氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、己烯雌酚、雙烯雌酚、雌酮、地塞米松進(jìn)行EPI掃描,并編寫7種藥物的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫,包括分子式、分子量、CAS編號、化學(xué)名、結(jié)構(gòu)圖等信息。另一個(gè)基于化合物保留時(shí)間的數(shù)據(jù)庫,包括化合物的保留時(shí)間、準(zhǔn)分子離子峰、特征碎片離子峰、碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)。實(shí)驗(yàn)過程中,利用保留時(shí)間在文本數(shù)據(jù)庫中的信息編寫MRM采集方法,隨后設(shè)定IDA條件,當(dāng)色譜峰滿足信號強(qiáng)度條件時(shí)將激發(fā)EPI掃描。

1.5樣品處理

稱取5.0 g水產(chǎn)品肉糜于100 mL離心管中,精確至0.01 g,加入20 mL 5% 醋酸乙腈提取液,同時(shí)加入2.0 g氯化鈉和8.0 g無水硫酸鈉均質(zhì)提取1 min, 4 500 r/min 離心5 min,將上清液移入50 mL含750 mg C18分散劑的具塞離心管中,加入5 mL乙腈,水平振蕩5 min,使吸附劑和提取液充分接觸,以4 500 r/min離心5 min,靜置10 min沉淀蛋白后,取5 mL上清液(相當(dāng)于1.0 g樣品)于10 mL試管中,40 ℃下氮吹濃縮至干。加入1 mL甲醇-水(1∶4)的定容液,經(jīng)超聲溶解和渦旋混勻后,過0.22 μm濾膜,供LC-MS/MS測定。

1.6檢測模式

實(shí)驗(yàn)過程中,利用基于化合物保留時(shí)間的數(shù)據(jù)庫找出所需監(jiān)測化合物的MRM以及保留時(shí)間等數(shù)據(jù)信息,編輯MRM掃描方式,設(shè)定IDA→EPI實(shí)驗(yàn)條件,這里所有監(jiān)測化合物均以CE為35 eV,CES為15 eV的擴(kuò)展能量的碰撞能量記錄MS/MS質(zhì)譜數(shù)據(jù),以便與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對比,實(shí)驗(yàn)中MRM→IDA→EPI的運(yùn)行邏輯見圖1。

步驟1 MRM探測掃描；步驟2 系統(tǒng)自動(dòng)判斷：探測掃描采集到的MRM信號強(qiáng)度超過預(yù)設(shè)值；步驟3 當(dāng)步驟2的條件滿足時(shí)，系統(tǒng)IDA自動(dòng)切換(<1ms)為線性離子阱模式，進(jìn)行增強(qiáng)子離子掃描(EPI)，獲得探測掃描所得之母離子的高質(zhì)量MS2譜圖；否則返回步驟1，運(yùn)行MRM掃描。

圖1 MRM→IDA→EPI的運(yùn)行邏輯圖

2 結(jié)果與討論

2.1質(zhì)譜參數(shù)

通過優(yōu)化離子源參數(shù),得到7種化合物的最佳質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果

采用2.1中質(zhì)譜參數(shù),得到其中化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為10 ng/mL的MRM總離子流圖(見圖2)。

圖2 7種化合物的MRM總離子流圖

2.3數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建

以氟苯尼考為例,同時(shí)采集空白基質(zhì)添加標(biāo)準(zhǔn)品濃度為10 ng/mL的MRM和EPI數(shù)據(jù),分別得到MRM總離子流圖和富集的二級子離子全掃描質(zhì)譜圖。記錄氟苯尼考的MRM色譜峰保留時(shí)間,以及在軟件上添加富集的二級子離子全掃描EPI質(zhì)譜圖,同時(shí)用于化合物的鑒定。圖3中展示監(jiān)控氟苯尼考得到的導(dǎo)航圖。其中圖3a為總離子流圖,圖3b為MRM的質(zhì)譜圖、圖3c為MRM的色譜圖,圖3d為對應(yīng)圖3c中的全掃描質(zhì)譜圖。

選擇圖3d,點(diǎn)擊鼠標(biāo)右鍵,添加氟苯尼考的二級質(zhì)譜圖(Add a record,見圖4),同時(shí)補(bǔ)充化合物名稱、分子式、CAS號等相關(guān)信息,即可完成譜庫的添加。按此方法得到氯霉素、甲砜霉素、己烯雌酚、雙烯雌酚、雌酮、地塞米松6種藥物的數(shù)據(jù)庫信息。

圖3 氟苯尼考導(dǎo)航圖

圖4 添加二級質(zhì)譜圖

2.4數(shù)據(jù)庫的應(yīng)用

實(shí)際掃描過程中,一旦某MRM通道采集的信號強(qiáng)度超過預(yù)設(shè)值后,即觸發(fā)EPI增強(qiáng)子離子掃描模式,進(jìn)而獲得對應(yīng)MRM通道的母離子的增強(qiáng)二級子離子全掃描質(zhì)譜圖,該EPI譜庫可進(jìn)行定性檢索,得到相應(yīng)的匹配度。匹配度的大小用以確證目標(biāo)化合物的真?zhèn)?從而實(shí)現(xiàn)定性功能;與此同時(shí),MRM通道采集的信號依然可以作為定量分析的數(shù)據(jù),能夠?qū)崿F(xiàn)對目標(biāo)化合物的同時(shí)定性定量分析,大大提高了工作效率。

2.5陽性樣品鑒定

實(shí)驗(yàn)中,由于色譜分離的局限性,不能確定在保留時(shí)間誤差范圍內(nèi)出現(xiàn)的色譜峰為氟苯尼考,此時(shí)需要借助EPI數(shù)據(jù)庫分析色譜峰。將未知樣品采集進(jìn)行EPI數(shù)據(jù)譜庫檢索,軟件自動(dòng)給出匹配值(正匹配值/反匹配值)用于色譜峰鑒定見圖5。

將樣品的EPI譜圖與空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品加標(biāo)建立的EPI譜庫中譜圖進(jìn)行比較,通過比較二級質(zhì)譜圖,未知樣品EPI質(zhì)譜圖(圖5a)與氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)溶液EPI質(zhì)譜圖(圖5b)極為相似,與芐哌丁苯(圖5c)相差甚遠(yuǎn)。并且得到它們的匹配結(jié)果(圖5d),其中Fit值( 匹配值)是用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)譜圖與可疑樣品譜圖進(jìn)行對比后獲得的相似度值,滿分為100,Fit值越大可信度越高說明該化合物的可能性越大;Revfit值(反相匹配值)是用可疑樣品譜圖與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)譜圖進(jìn)行對比后獲得的相似度值;Purity 值(純度值)是綜合前兩種結(jié)果得出的數(shù)值。檢索結(jié)果按Purity值從大到小排序,從表中可明顯得出可疑陽性樣品中氟苯尼考陽性的結(jié)論。

圖5 氟苯尼考陽性樣品確證

2.6精密度與檢測限

取處理好的水產(chǎn)品提取液注入QTrap系統(tǒng)中,采集5 ng/mL基質(zhì)加標(biāo)時(shí)得出信噪比分別為:氯霉素≥36、甲砜霉素≥23、氟苯尼考≥30、己烯雌酚≥23、雙烯雌酚≥4、雌酮≥12、地塞米松≥221。按照S/N≥3為方法的檢測限,出于簡便和實(shí)際意義角度考慮,將7種負(fù)離子的檢出限統(tǒng)一定為5 μg/kg。按照同樣方法,S/N≥10為方法的定量限為10 μg/kg。

配制10～5 000 ng/mL的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,采集數(shù)據(jù)并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到7種化合物的線性相關(guān)系數(shù)R為0.993 6～0.999 9,線性良好。每種獸藥添加10 μg/kg、50 μg/kg、100 μg/kg 3個(gè)水平到空白基質(zhì)中,每個(gè)水平重復(fù)6次,得到回收率為83.2%～105.8%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為4.9%～10.2%,完全滿足日常實(shí)驗(yàn)室檢測的重現(xiàn)性要求。

2.7實(shí)際樣品測試

購市售水產(chǎn)品按照1.5步驟處理,經(jīng)液相色譜質(zhì)譜測試,通過空白基質(zhì)添加的方式驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性。檢驗(yàn)15種水產(chǎn)品中均未檢出陽性樣品。

3 結(jié)論

日常工作中,由于檢測樣品基質(zhì)比較復(fù)雜,檢驗(yàn)過程中常出現(xiàn)大量假陽性的情況。針對該狀況采用QTrap質(zhì)譜特有的MRM→IDA→EPI掃描,實(shí)現(xiàn)一次進(jìn)樣定性定量,大大簡化檢驗(yàn)流程,增強(qiáng)檢測結(jié)果信心,有效確認(rèn)化合物真?zhèn)?。?shù)據(jù)庫建立過程,簡單快捷,可實(shí)現(xiàn)一次進(jìn)樣得到樣本的定量和定性數(shù)據(jù),極大地提高工作效率。此外,實(shí)驗(yàn)證明由于QTrap系統(tǒng)的富集功能,能夠?qū)崿F(xiàn)即使在低濃度條件下,依然可以得到化合物高質(zhì)量的二級質(zhì)譜圖,對于限量較低的藥物的篩查確證非常實(shí)用。

[ 1 ]YAMAD R, KOZONO M, OHMORI T, et al. Biosic. Biotechnol[J]. Biochem, 2006,70(1):54-65.

[ 2 ]European Commission. Commission regulation (EU) No 37/2010[EB/OL]. (2009-09-22) [2014-02-10]. http:∥wenku.baidu.com/link?url=x2q8qg-5NtJpbU5A3W_tecicvnldVKtggi6sz-gNDaHzlI4W5Yr1BPduIxyStrhbo ShPynLiY99bwBleOLd_DeH_y58i5Xo18aTHIZcHOrS.

[ 3 ]中華人民共和國農(nóng)業(yè)部. 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第235[EB/OL]. (2002-12-24)[2014-01-28]. http:∥www.moa.gov.cn/zwllm/nybz/200803/t20080304_1028649.htm.

[ 4 ]楊秀娟,張曦. 動(dòng)物源食品中抗生素殘留檢測分析方法的研究[J]. 檢測分析, 2004(18):25-27.

[ 5 ]宓曉黎. 動(dòng)物源性食品中四環(huán)素殘留的檢測技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 食品研究與開發(fā), 2004,25(5):137-143.

[ 6 ]謝愷舟,徐東,陳書琴,等. 高效液相色譜熒光檢測法同時(shí)檢測雞肉中甲砜霉素、氟苯尼考及氟苯尼考胺殘留[J]. 分析試驗(yàn)室, 2011,30(7):31-36.

[ 7 ]王秉棟. 食品衛(wèi)生檢驗(yàn)手冊[M]. 上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社, 2003.

[ 8 ]張挪威,劉國艷,宋巍巍,等. 基于分子印跡膜的檢測牛奶中琥珀酸氯霉素殘留傳感方法的研究[J]. 分析化學(xué)研究報(bào)告, 2008,10:1380-1384.

[ 9 ]魏林陽,徐金晶,吳紅軍. 水產(chǎn)品中氯霉素殘留的氣質(zhì)聯(lián)用法檢測[J]. 光譜實(shí)驗(yàn)室, 2007,24(2):201-205.

[10]萬位寧,陳熹,居學(xué)海,等. 固相萃取-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)檢測禽畜糞便中多種抗生素殘留[J]. 分析化學(xué)研究報(bào)告, 2013,41(7):993-999.

[11]陶昕晨,黃和,廖建萌,等. 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)檢測蝦肉和豬肉中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和其代謝產(chǎn)物氟苯尼考胺殘留[J]. 中國食品學(xué)報(bào), 2014,14(1):232-239.

[12]孫雷,張?bào)P,王樹槐,等. 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測動(dòng)物源食品中氯霉素類藥物及其代謝物殘留[J]. 中國獸藥雜志, 2009,43(3):42-45.

[13]殷平,陳舜勝,鄧曉軍,等. 液質(zhì)聯(lián)用檢測水產(chǎn)品中氯霉素、氟苯尼考和甲砜氯霉素的殘留量[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2007,23(10):83-88.

[14]中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會. GB/T 22338—2008. 動(dòng)物源性食品中氯霉素類藥物殘留量測定[S]. 北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2008.

[15]中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會. GB/T 20756—2006可食動(dòng)物肌肉、肝臟和水產(chǎn)品中氯 霉素、甲砜霉素和氟苯尼考?xì)埩袅康臏y定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[S]. 北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2006.

[16]中華人民共和國農(nóng)業(yè)部. 農(nóng)業(yè)部1031號公告-2-2008. 動(dòng)物源性食品中糖皮質(zhì)激素類藥物多殘留檢測 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[S]. 北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2008.

[17]李周敏,邵誠,方惠群. 蜂蜜中殘留抗生素的檢測方法研究[J]. 安徽醫(yī)藥, 2012,16(5):568-570.

[18]李正豐,馬效國,黃安倉. 動(dòng)物源性食品中抗生素殘留及檢測技術(shù)的研究[J]. 甘肅畜牧獸醫(yī), 2011(1):41-45.

Developmentofveterinarydrugsdatalibraryandscreeningmethodofnegativemodebyliquidchromatography-tandemmassspectrometryinaquaticproducts

JINYan1,LIUYu1,LIXiaodong1,ZHAOYing1,JIANGShi1,ZHONGYu1,ZHENGChen2

(1. Shenyang Enter-exit Inspection and Quarantine Bureau of the P.R.China, Shenyang 110016, China; 2. AB SCIEX Asia Pacific Application Support Center, Shanghai 200233, China)

A liquid chromatography tandem triple-quadrupole linear ion trap mass spectrometric (QTrap LC-MS/MS) EPI mode was developed for the data library and simultaneous screening of veterinary drugs residual in aquatic products. The results showed that the limits of detection (LOD, S/N≥3) were 5 μg/kg and the limits of quantity(LOQ, S/N≥10) was 10 μg/kg for the veterinary drugs. The average recoveries (n=6) of the veterinary drugs in aquatic product samples at three levels 10 μg/kg、50 μg/kg、100 μg/kg were from 83.2% to 105.8% with the relative standard deviations (RSD) between 4.9% and 10.2%. Besides using two transitions and retention time, product ions were matched with the data libraries to identification the compounds. This process is proved to exclude the false positive samples effectively. The setting of the data library is quick and easy, and the ion-trap will help to apply the qualitative and quantitative determination of veterinary drugs in aquatic products with sensitive and accurate characteristics.

QTrap LC-MS/MS; data Library; veterinary drug screening; aquatic products

2014-04-26。

國家質(zhì)檢總局科技計(jì)劃項(xiàng)目(2011IK215,2014IK129); “十二五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2011BAK10B04-9); 遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局科技計(jì)劃項(xiàng)目(LK33-2007)。

金 雁(1974-),女,遼寧沈陽人,沈陽出入境檢驗(yàn)檢疫局高級工程師,碩士。

1673-5862(2014)04-0496-06

O661.1

: A

10.3969/ j.issn.1673-5862.2014.04.009