張治平，司軍強(qiáng)，李新芝，李 麗，趙 磊，魏麗麗，于秀石，馬克濤△

（石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院：1.生理學(xué)教研室；2.病理生理學(xué)教研室，新疆石河子832002）

氟滅酸（flufenamic acid，F(xiàn)FA）是臨床常見的非甾體抗炎藥物，研究發(fā)現(xiàn)氟滅酸能夠阻斷Cl－通道［1－2］、調(diào)節(jié)非選擇性陽離子通道［3－4］，還可以抑制培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞和神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞間的縫隙連接通道［5］。本實(shí)驗(yàn)主要研究氟滅酸對急性分離的微動(dòng)脈細(xì)胞間縫隙連接通道的電生理特性影響。許多組織和器官上都表達(dá)有縫隙連接存通道，是細(xì)胞間進(jìn)行電化學(xué)信息通訊的直接途徑［6－7］?？p隙連接通道由相鄰的兩個(gè)細(xì)胞各提供一個(gè)連接子對接而成，每個(gè)連接子由6個(gè)不同或相同的連接蛋白（connexin，Cx）構(gòu)成，縫隙連接通道的孔徑約1.5nm，允許相對分子量小于1KD的分子通過。目前發(fā)現(xiàn)超過20種Cx表達(dá)在不同的細(xì)胞［6，8］。

縫隙連接在維持人體正常生理功能中扮演著重要角色，在血管舒縮運(yùn)動(dòng)中更為突出［9－13］。調(diào)節(jié)血管舒縮運(yùn)動(dòng)的電、化學(xué)信息在平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞之間傳遞，以及平滑肌細(xì)胞的同步化都需要縫隙連接功能和結(jié)構(gòu)的完整性［9，14］。為了研究縫隙連接在生理和病理生理狀態(tài)下所發(fā)揮的作用，特異性縫隙連接阻斷劑是必不可少的。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)的細(xì)胞上氟滅酸能夠抑制細(xì)胞間的縫隙連接通訊［5］，但在急性分離的血管段標(biāo)本上尚未見相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用微動(dòng)脈段全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)在急性分離的腦動(dòng)脈（brain？artery，BA）和腸系膜動(dòng)脈（mesenteric artery，MA）上，研究氟滅酸對血管平滑肌細(xì)胞間縫隙連接通道電生理特性的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)所用豚鼠（新疆維吾爾自治區(qū)疾病控制中心動(dòng)物飼養(yǎng)科提供，動(dòng)物質(zhì)量符合一級標(biāo)準(zhǔn)）雌雄不限，體質(zhì)量約200～300g，麻醉狀況下放血處死，迅速取出腸系膜和腦，置于生理鹽溶液中，生理鹽溶液成分如下：NaCl 138.0mmol／L，KCl 5.0mmol／L，CaCl21.6mmol／L，MgCl21.2mmol／L，Na－HEPES 5.0mmol／L，HEPES 6.0mmol／L，葡萄糖7.5mmol／L。生理鹽溶液中迅速取出BA和MA。所用藥物用生理鹽溶液配制，通過開關(guān)控制藥物灌流標(biāo)本，保持灌流速度、溫度和其他成分不變。所用藥物有：氟滅酸由Sigma公司提供，其余試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 微動(dòng)脈段標(biāo)本制備 截取好的微動(dòng)脈標(biāo)本置于直徑35mm的培養(yǎng)皿中，血管微動(dòng)脈長約0.4mm，直徑在40～80 μm之間，兩端用細(xì)鉑金片固定在培養(yǎng)皿底部，在37℃溫箱中用含有膠原酶A（1.5mg／mL）的生理鹽溶液處理15min，生理鹽溶液置換2次去除殘存膠原酶A，體顯微鑷下進(jìn)一步去除附在微動(dòng)脈上的結(jié)締組織。

表1 微動(dòng)脈段上和單個(gè)平滑肌細(xì)胞的膜電生理特性的比較

1.2.2 單個(gè)平滑肌細(xì)胞制備 將微動(dòng)脈置于細(xì)胞分離液中20min，細(xì)胞分離液成分為：NaCl 142.00mmol／L，KCl 5.00 mmol／L，CaCl20.05mmol／L，MgCl21.00mmol／L，Na－HEPES 4.00mmol／L，HEPES 5.00mmol／L，葡萄糖 7.50 mmol／L。將微動(dòng)脈剪成幾段放入消化液后，在37℃溫箱中消化20～25min，消化液成分包括：木瓜蛋白酶0.75mg／mL，膠原酶Ⅰ1.00mg／mL，牛血清清蛋白3.75mg／mL，二硫蘇糖醇0.30mg／mL。1 000r／min離心6min后棄上清液，加入細(xì)胞分離液制成細(xì)胞懸浮液，如此反復(fù)替換3次后，將液體移至用多聚賴氨酸處理過的培養(yǎng)皿內(nèi)，靜置30min使細(xì)胞貼壁。生理鹽溶液沖洗20min后進(jìn)行全細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 全細(xì)胞膜片鉗記錄 室溫條件下（22～25℃）標(biāo)本持續(xù)灌注生理鹽溶液（0.2mL／min）進(jìn)行全細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn)。記錄電極阻抗約為5MΩ，P－97拉制儀拉制。電極內(nèi)液成分是：K－gluconate 130.0mmol／L，NaCl 10.0mmol／L，CaCl22.0 mmol／L，MgCl21.2mmol／L，HEPES 10.0mmol／L，EGTA 5.0mmol／L，葡萄糖7.5mmol／L。通過微操縱器接觸到細(xì)胞后給予負(fù)壓形成GΩ封接。補(bǔ)償電極電容后給予瞬時(shí)較強(qiáng)負(fù)壓或者電刺激擊破細(xì)胞膜形成全細(xì)胞膜片鉗，膜電流用10 kHz（－3dB）低頻濾過［15］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 微動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞間的縫隙連接 微動(dòng)脈段上和單個(gè)平滑肌細(xì)胞的細(xì)胞膜電生理特性（表1），MA和BA微動(dòng)脈段上平滑肌細(xì)胞Cinput大約是消化分離的單個(gè)平滑肌細(xì)胞的10倍，Ginput大約是單個(gè)平滑肌細(xì)胞的20倍。

圖1 氟滅酸對微動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞間縫隙連接的抑制作用

2.2 氟滅酸抑制微動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞間的縫隙連接 應(yīng)用氟滅酸前細(xì)胞膜電流幅度顯著大于應(yīng)用氟滅酸（300μmol／L）后（圖1），細(xì)胞Rinput從0.32GΩ增加到2.15GΩ。表2總結(jié)了氟滅酸對微動(dòng)脈段平滑肌細(xì)胞Cinput、Rinput和Ginput的影響，應(yīng)用氟滅酸干預(yù)后記錄平滑肌細(xì)胞的Cinput、Rinput和Ginput與表1中單個(gè)細(xì)胞的數(shù)值十分接近。此外，應(yīng)用單指數(shù)方程分別對氟滅酸干預(yù)和對照組記錄平滑肌細(xì)胞膜電容充放電過程進(jìn)行擬合。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氟滅酸干預(yù)前擬合效果較差（r≤0.90），干預(yù)后擬合效果較好（r＞0.98），細(xì)胞Cinput的充放電的時(shí)間常數(shù)也由11.00ms減少至0.32ms。

表2 氟滅酸對微動(dòng)脈段上平滑肌細(xì)胞膜電生理特性的影響

應(yīng)用斜坡電壓刺激顯示氟滅酸凈電流的電流／電壓（I／V）曲線呈線性（圖2），且微動(dòng)脈段上記錄平滑肌細(xì)胞的靜息電位與翻轉(zhuǎn)電位點(diǎn)十分接近，提示氟滅酸主要抑制相鄰細(xì)胞間縫隙連接通道。

圖2 氟滅酸凈電流的I／V曲線

圖3 氟滅酸濃度依賴的抑制微動(dòng)脈上平滑肌細(xì)胞膜電導(dǎo)

2.3 氟滅酸濃度依賴的抑制微動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞間縫隙連接氟滅酸可以濃度依賴性的抑制微動(dòng)脈上平滑肌細(xì)胞間縫隙連接（圖3），氟滅酸（1～1 000μmol／L）能夠濃度依賴的減少微動(dòng)脈段上平滑肌細(xì)胞的Ginput。經(jīng)繪制曲線發(fā)現(xiàn)氟滅酸抑制BA和MA細(xì)胞間縫隙連接通道的IC50分別為33和56μmol／L，氟滅酸抑制兩種微動(dòng)脈細(xì)胞間縫隙連接通道的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)在BA和MA上通過以下3個(gè)方面得以證實(shí)氟滅酸可以可逆和濃度依賴的抑制細(xì)胞間縫隙連接通訊：（1）氟滅酸能夠增加微動(dòng)脈段上平滑肌細(xì)胞的Rinput至單個(gè)平滑肌細(xì)胞水平；（2）氟滅酸可以減小微動(dòng)脈段上平滑肌細(xì)胞Cinput值和Ginput值接近于單個(gè)細(xì)胞；（3）氟滅酸后能夠降低細(xì)胞膜充放電時(shí)間至單個(gè)細(xì)胞水平，且單指數(shù)方程能夠較好的擬合［16－17］。結(jié)果提示，當(dāng)氟滅酸的濃度≧300μmol／L時(shí)BA和MA微動(dòng)脈段上平滑肌細(xì)胞間的縫隙連接通道可以被完全抑制。此外，氟滅酸對BA和MA兩種微動(dòng)脈細(xì)胞間縫隙連接通道的抑制作用無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示相同的連接蛋白表達(dá)在上述兩種微動(dòng)脈。

Harks等［18］報(bào)道在健康大鼠腎成纖維細(xì)胞和過表達(dá)Cx43的SKHep1細(xì)胞上氟滅酸可以阻斷細(xì)胞間的縫隙連接通訊，IC50是40μmol／L，當(dāng)濃度大于或等于250μmol／L時(shí)氟滅酸可以完全阻斷細(xì)胞間的縫隙連接通訊。此結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致。血管微動(dòng)脈主要表達(dá)Cx37、Cx40、Cx43和Cx45，其中平滑肌細(xì)胞上主要表達(dá)Cx37、Cx43和Cx45，內(nèi)皮細(xì)胞上主要表達(dá)Cx37、Cx40和Cx43［13］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，在 MA和BA微動(dòng)脈上平滑肌細(xì)胞間縫隙連接通道可能是由Cx43和其他幾種連接蛋白組成的異聚體。另有文獻(xiàn)報(bào)道，在N2A神經(jīng)母細(xì)胞瘤上氟滅酸能夠非選擇性阻斷由Cx26、Cx32、Cx40、Cx43、Cx46和Cx50分別組成的縫隙連接通道［19］。

縫隙連接是相鄰細(xì)胞間的連接通道排列而組成的一種特殊膜結(jié)構(gòu)，能夠允許某些離子以及相對分子質(zhì)量小于1×103的分子自由通過，是細(xì)胞間進(jìn)行物質(zhì)交換和信息通訊的途徑［20］。縫隙連接與血管緊張度的調(diào)節(jié)密切相關(guān)，通過縫隙連接電化學(xué)信號的直接交流，使血管能夠保持電和機(jī)械活動(dòng)的同步性，對刺激信息作出同步性的反應(yīng)，保證血管舒縮功能的一致和穩(wěn)定。病理情況下，傷害性信息也能夠相鄰細(xì)胞間存在的縫隙連接通道進(jìn)入正常細(xì)胞，進(jìn)而使正常細(xì)胞出現(xiàn)病理性改變［9］，如果提前應(yīng)該縫隙連接阻斷劑阻斷異常細(xì)胞與正常細(xì)胞間的縫隙連接通道，則傷害性信息不會(huì)傳遞至正常細(xì)胞。Saltman等［21］發(fā)現(xiàn)在心肌梗死的動(dòng)物模型上提前應(yīng)用了縫隙連接阻斷劑庚醇，心肌梗死的面積顯著降低。因此，縫隙連接阻斷劑將會(huì)是治療心腦血管疾病非常重要的工具。

［1］Duran C，Thompson CH，Xiao Q，et al.Chloride channels：often enigmatic，rarely predictable［J］.Annu Rev Physiol，2010，72：95－121.

［2］Hartzell C，Putzier I，Arreola J.Calcium－activated chloride channels［J］.Annu Rev Physiol，2005，67：719－758.

［3］Hill K，Benham CD，McNulty S，et al.Flufenamic acid is a pH－dependent antagonist of TRPM2channels［J］.Neuropharmacology，2004，47（3）：450－460.

［4］Saleh SN，Albert AP，Peppiatt CM，et al.AngiotensinⅡactivates two cation conductances with distinct TRPC1 and TRPC6channel properties in rabbit mesenteric artery myocytes［J］.J Physiol，2006，577（Pt 2）：479－495.

［5］Juszczak GR，Swiergiel AH.Properties of gap junction blockers and their behavioural，cognitive and electrophysiological effects：animal and human studies［J］.Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry，2009，33（2）：181－198.

［6］McCracken CB，Roberts DC.Neuronal gap junctions：expression，function，and implications for behavior［J］.International review of neurobiology，2006，73：125－51.

［7］Sohl G，Maxeiner S，Willecke K.Expression and functions of neuronal gap junctions［J］.Nat Rev Neurosci，2005，6（3）：191－200.

［8］Tran CH，Welsh DG.Current perspective on differential communication in small resistance arteries［J］.Can J Physiol pharmacol，2009，87（1）：21－28.

［9］Figueroa XF，Isakson BE，Duling BR.Connexins：gaps in our knowledge of vascular function［J］.Physiology（Bethesda），2004，19：277－284.

［10］Griffith TM.Endothelium－dependent smooth muscle hyperpolarization：do gap junctions provide a unifying hypothesis［J］.Br J Pharmacol，2004，141（6）：881－903.

［11］Sandow SL.Factors，fiction and endothelium－derived hyperpolarizing factor［J］.Clin Exp Pharmacol Physiol，2004，31（9）：563－570.

［12］Jiang ZG，Nuttall AL，Zhao H，et al.Electrical coupling and release of K＋from endothelial cells co－mediate AChinduced smooth muscle hyperpolarization in guinea－pig inner ear artery［J］.J Physiol，2005，564（Pt 2）：475－487.

［13］Figueroa XF，Isakson BE，Duling BR.Vascular gap junctions in hypertension［J］.Hypertension，2006，48（5）：804－811.

［14］Segal SS.Regulation of blood flow in the microcirculation［J］.Microcirculation，2005，12（1）：33－45.

［15］陳新燕，司軍強(qiáng)，李麗，等.18β甘草次酸對 Wistar大鼠和自發(fā)性高血壓大鼠腦微動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞縫隙連接的影響［J］.中國應(yīng)用生理學(xué)雜志，2013，29（2）：181－184.

［16］Lindau M，Neher E.Patch－clamp techniques for time－resolved capacitance measurements in single cells［J］.Pflugers Arch，1988，411（2）：137－146.

［17］de Roos，AD，van Zoelen EJ，Theuvenet AP.Determination of gap junctional intercellular communication by capacitance measurements［J］.Pflugers Arch，1996，431（4）：556－563.

［18］Harks EG，de Roos AD，Peters PH，et al.Fenamates：a novel class of reversible gap junction blockers［J］.J Pharmacol Exp Ther，2001，298（3）：1033－1041.

［19］Srinivas M，Spray DC.Closure of gap junction channels by arylaminobenzoates［J］.Mol Pharmacol，2003，63（6）：1389－1397.

［20］Mese G，Richard G，White TW.Gap junctions：basic structure and function［J］.J Invest Dermatol，2007，127（11）：2516－2524.

［21］Saltman AE，Aksehirli TO，Valiunas V，et al.Gap junction uncoupling protects the heart against ischemia［J］.J Thoracic Cardiovascular Surg，2002，124（2）：371－376.