羅海波，呂愛貞，盧 曉，富 寧，吳 砂，鄭 華

（1.廣州軍區(qū)解放軍第421醫(yī)院檢驗輸血科，廣州510310；2.南方醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院免疫學教研室，廣州510515；3.南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院心內(nèi)科，廣州510515）

心血管狹窄引起的冠心病已經(jīng)成為危及人類生命健康的主要疾病之一，向病變血管內(nèi)置入金屬支架，成為目前治療冠狀動脈及其他外周動脈疾病有效的治療方法［1］。目前常用的材料有鉭、醫(yī)用不銹鋼及鎳鈦合金等。近年來發(fā)現(xiàn)，這些金屬材料支架會影響單核巨噬細胞功能，引發(fā)過敏反應［2］。但對單核巨噬細胞其他功能的影響卻未做深入研究。

單核巨噬細胞的重要功能之一就是抗感染，通過多種方式能識別多種病原微生物關(guān)鍵成分，從而發(fā)揮清除病原微生物的目的。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革蘭陰性菌細胞壁的重要組成部分，對細胞的生長與持續(xù)極為重要，單核巨噬細胞通過其表面Toll樣受體4（Toll like receptor 4，TLR4）－LPS識別革蘭陰性菌，誘發(fā)一系列的炎性反應及免疫應答［3］。本研究利用鎳鈦合金心血管支架（nickel－titanium stent，NTS）作用單核巨噬細胞系Raw264.7細胞，檢查其影響單核巨噬細胞應答LPS的能力及其胞內(nèi)炎癥相關(guān)的信號通路改變，從而探討NTS對單核巨噬細胞抗感染能力，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 PE標記抗小鼠FasL、CD80、CD86抗體均購自美國Biolegend公司。小鼠IL－6、TNF－α的ELISA試劑盒均購自美國Biolegend公司。LPS購自美國Sigma公司。Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司。Luciferase Assay購自美國Promega公司。pGL4.32－luc2P／NF－κκB－RE／Hygro Vector購自美國Promega公司。干擾素－γ（GAS）、干擾素刺激反應元件（ISRE）、信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄活化因子（STAT3）信號通路質(zhì)粒均購自美國Clontech公司。不完全培養(yǎng)基RPMI－1640及新生小牛血清均購自美國Gibco公司。胰蛋白酶購自廣州威佳科技有限公司。NTS為荷蘭Orbusneich公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 單核巨噬細胞培養(yǎng) Raw264.7細胞用含10%新生小牛血清的完全培養(yǎng)基RPMI－1640在37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。

1.2.2 地塞米松（DX）刺激Raw264.7細胞 于Raw264.7細胞中加入10－6mol／L DX培養(yǎng)4d（DX－Raw264.7細胞）。

1.2.3 NTS刺激Raw264.7細胞及DX－Raw264.7細胞 調(diào)整細胞密度為1×106／mL，于培養(yǎng)的Raw264.7細胞及DXRaw264.7細胞中加入NTS培養(yǎng)4d。

1.2.4 LPS刺激經(jīng)支架作用后的Raw264.7細胞及DXRaw264.7細胞 于經(jīng)NTS作用后的Raw264.7細胞及DXRaw264.7細胞中加入LPS培養(yǎng)24h，收集細胞培養(yǎng)上清液，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗2遍待檢。

1.2.5 流式細胞儀檢測 調(diào)整細胞密度為1×106／mL，分別標記抗體PE－FasL、PE－CD80。4℃孵育30min，PBS洗2遍，加入0.5mL PBS重懸，流式細胞儀進行分析。

1.2.6 細胞因子檢測 根據(jù)小鼠IL－6、TNF－α的ELISA試劑盒說明書檢測Raw264.7細胞及DX－Raw264.7細胞培養(yǎng)上清液中IL－6和 TNF－α。

1.2.7 信號通路活化檢測 鋪板，將每孔的細胞密度調(diào)整為1×105／mL，按Lipofectamine 2000說明書將pGL4.32［luc2P／NF－κκB－RE／Hygro］Vector、pTA－GAS－luc、pTA－ISRE－luc和pTA－STAT3－luc信號通路活化質(zhì)粒轉(zhuǎn)染各組Raw264.7細胞及DX－Raw264.7細胞，24h后收集細胞裂解液，熒光素酶試劑盒進行檢測。

1.2.8 根據(jù)不同處理方式分組 分為：對照空白組，單純NTS組，單純LPS作用組，NTS作用后LPS反應組，RAW264.7組：單核細胞系264.7，DX－Raw264.7組：DX作用單核細胞系。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行分析，所用的統(tǒng)計學方法為t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 NTS作用后LPS對Raw264.7及DX－Raw264.7細胞表面共刺激分子的影響 NTS作用后經(jīng)過LPS刺激時，Raw264.7細胞CD80的表達明顯高于LPS單獨刺激組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。而DX預處理組，NTS影響差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖1。

圖1 NTS作用后LPS對Raw264.7及DX－Raw264.7細胞表達CD80的影響

2.2 NTS作用后LPS對單核巨噬細胞Raw264.7合成促炎癥因子的影響 在NTS單獨作用下，Raw264.7組分泌IL－6及TNF－α明顯高于空白對照組，但經(jīng)NTS作用后，應對LPS刺激時Raw264.7組分泌IL－6明顯低于LPS單獨刺激組。但Raw264.7組經(jīng)過DX事先處理后，各組IL－6的分泌差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而且NTS與LPS對單核巨噬細胞的影響都明顯受到了抑制，弱于Raw264.7組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖2。

圖2 NTS作用后LPS對Raw264.7細胞及DX－Raw264.7細胞分泌IL－6及TNF－α的影響

2.3 NTS作用后LPS對單核巨噬細胞Raw264.7細胞表面FasL類分子表達的影響 經(jīng)NTS作用后，LPS誘導的Raw264.7細胞FasL的表達明顯低于LPS單獨刺激組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。但Raw264.7細胞經(jīng)過DX事先處理后，DX－Raw264.7細胞經(jīng)NTS單獨刺激后，F(xiàn)asL的表達明顯低于空白對照組，經(jīng)LPS單獨刺激后，F(xiàn)asL的表達明顯高于空白對照組，而低于NTS與LPS共同刺激組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。在LPS單獨刺激下，DX－Raw264.7組表面FasL的表達明顯高于Raw264.7組，在NTS與LPS共同刺激下，DX－Raw264.7組表面FasL的表達同樣明顯高于Raw264.7組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖3。

圖3 NTS作用后LPS對Raw264.7細胞及DX－Raw264.7細胞表達FasL的影響

圖4 NTS作用后LPS對Raw264.7細胞及DX－Raw264.7細胞胞內(nèi)NF－κB信號通路活化的影響

圖5 NTS作用后LPS對Raw264.7細胞及DX－Raw264.7細胞胞內(nèi)GAS信號通路活化的影響

圖7 NTS作用后LPS對Raw264.7細胞及DX－Raw264.7細胞胞內(nèi)STAT3信號通路活化的影響

2.4 NTS作用對Raw264.7細胞信號通路的影響。NTS作用后，明顯抑制LPS對NF－κB的活化作用，但LPS介導的GAS，ISRE及STAT3等通路無明顯影響。但Raw264.7細胞經(jīng)過DX事先處理后，NTS單獨就可活化 NF－κB、GAS、ISRE及STAT3等一系列信號通路，但鎳鈦合金影響LPS介導的信號活化，DX－Raw264.7組與Raw264.7組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖4～7。

3 討 論

動脈粥樣硬化是心血管疾病死亡的重要原因之一，目前主要是通過向動脈狹窄部位植入金屬支架，使病變部位動脈保持血流暢通以達到治療疾病的目的［4］。然而，金屬支架作為一種外來異物，植入人體后會引起機體免疫功能發(fā)生改變?，F(xiàn)已證實，金屬支架植入后，雖然通過機械張力短時間內(nèi)改變血管狹窄，但由于金屬支架可刺激機體免疫細胞應答，局部形成炎性反應，造成支架周邊血管床炎癥，容易形成再狹窄，嚴重地影響了支架的作用［5］。對于支架材料的選擇與應用一直是一個難題。在本研究中，證實了在NTS單純作用下，基本上不引發(fā)單核巨噬細胞炎癥信號通路的活化，不產(chǎn)生炎癥因子，這點有利于進行術(shù)后恢復，這與文獻報道的鎳鈦合金支架作用處出現(xiàn)過敏性炎癥不同，由此似乎可以得到一種比較好的低免疫原性支架材料配比［6］。

單核巨噬細胞作為重要的吞噬細胞，對革蘭陰性菌的吞噬處理是其重要的免疫功能。LPS是革蘭陰性菌重要的胞壁組成成分，能與單核巨噬細胞表面TLR4分子結(jié)合，刺激免疫反應的發(fā)生。在哺乳動物體內(nèi)，TLR4是LPS最主要的識別受體［7］。LPS從細菌中釋放出來后，會與血液中的LPS結(jié)合蛋白（LBP）結(jié)合，再與巨噬細胞表面的甘油磷酸肌醇結(jié)合蛋白CD14結(jié)合，接著LPS被轉(zhuǎn)移到TLR4胞外段 MD－2上，刺激巨噬細胞，使其發(fā)生一系列的反應［2］。本研究著重觀察鎳鈦合金影響單核巨噬細胞對LPS應答的影響，結(jié)果證實，NTS作用后，單核巨噬細胞應答LPS時，其表面的殺傷性標志FasL及促炎癥因子IL－6的表達都明顯低于無支架作用時，說明NTS抑制了Raw264.7細胞對LPS的免疫應答，表明NTS可能會抑制單核巨噬細胞對革蘭陰性菌的應答。對于單核巨噬細胞，當其通過TLR4與LPS結(jié)合后，會活化巨噬細胞內(nèi)的NF－κB通路［8］。分泌多種促炎癥細胞因子，如IL－6、TNF－α等，引起一系列的炎性反應［9－10］。而鎳鈦合金明顯地抑制了這種LPS介導的NF－κB活化，降低了炎性反應。除此以外，對于感染，干擾素也是重要的抵抗因素，筆者關(guān)注了GAS或ISRE，這兩種與干擾素產(chǎn)生密切相關(guān)的信號通路的活化嚴格控制了干擾素的產(chǎn)生［11］，本研究中發(fā)現(xiàn)他們都沒受到影響，由此證實鎳鈦合金無法影響Ⅰ型及Ⅱ型干擾素的產(chǎn)生。

DX為糖皮質(zhì)激素的一種，具有抗炎、抗過敏等多種藥理作用，被臨床廣泛使用，在避免支架植入后狹窄中經(jīng)常使用，現(xiàn)在已經(jīng)將緩釋DX涂層應用于支架的報道減輕局部炎性反應［12］。在本研究中，DX可以明顯改變NTS的作用。DX單獨作用就可以明顯降低促炎癥因子及相關(guān)炎癥信號分子的活化，而鎳鈦合金對LPS介導的NF－κb活化的抑制效應也得到了放大，同時還影響了ISRE及STAT3信號的活化，進一步地抑制了抗炎作用。所以，DX在支架干擾LPS應答方面會加強這種抑制效果，使機體更難應答LPS。

綜上所述，NTS可通過抑制單核巨噬細胞NF－κB活化阻礙LPS的免疫應答，而DX則會進一步放大這種抑制效應。此研究有利于從臨床應用角度探討NTS的應用。

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