李俊州， 趙玉華， 文才藝， 臧 睿， 張 俊

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，河南 鄭州 450002)

內(nèi)生細(xì)菌EBS05對(duì)番茄病程相關(guān)蛋白的誘導(dǎo)作用研究

李俊州， 趙玉華， 文才藝， 臧 睿， 張 俊

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，河南 鄭州 450002)

以番茄江蔬14為材料，研究了內(nèi)生細(xì)菌EBS05對(duì)番茄病程相關(guān)蛋白基因表達(dá)的誘導(dǎo)作用，同時(shí)，測定了番茄體內(nèi)β-1,3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶活性變化.結(jié)果表明，內(nèi)生細(xì)菌EBS05可誘導(dǎo)番茄體內(nèi)PR1,PR2和PR3基因持續(xù)增量表達(dá)，并有效激活PR5基因表達(dá)，進(jìn)而提高番茄對(duì)番茄黃化曲葉病毒(TYLCCV)的系統(tǒng)抗性；內(nèi)生細(xì)菌EBS05誘導(dǎo)處理再接種TYLCCV后，番茄體內(nèi)β-1,3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶活性均明顯高于對(duì)照，并分別于接種后第7 d和第9 d達(dá)到活性峰值.結(jié)合TYLCCV侵染番茄的病程分析，β-1,3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶活性的升高與內(nèi)生細(xì)菌EBS05誘導(dǎo)番茄對(duì)TYLCCV的系統(tǒng)抗性呈正相關(guān).

內(nèi)生細(xì)菌；中國番茄黃化曲葉病毒；誘導(dǎo)抗性；病程相關(guān)蛋白

番茄黃化曲葉病毒病是由中國番茄黃化曲葉病毒(Tomato yellow leaf curl Chinavirus，TYLCCV)引起的一種番茄生產(chǎn)上的毀滅性病害[1]，主要由煙粉虱或嫁接傳播.近年來，隨著全球氣候變化和煙粉虱危害加重，番茄黃化曲葉病毒病在世界各地大面積暴發(fā)流行，發(fā)病地塊減產(chǎn)嚴(yán)重，給番茄產(chǎn)業(yè)造成了嚴(yán)重的損失[2,3].關(guān)于番茄黃化曲葉病毒病的防治，目前生產(chǎn)上主要通過選育抗病品種和化學(xué)藥劑控制煙粉虱等途徑.然而，由于該病害的發(fā)生機(jī)理尚不明確，抗源材料缺乏，利用抗病基因工程手段獲得抗病品種的研究還處在探索階段，生產(chǎn)上并沒有穩(wěn)定有效的抗病品種[4]，此外，化學(xué)防治容易導(dǎo)致作物藥害、農(nóng)藥殘留及昆蟲抗藥性等安全生產(chǎn)問題.因此，利用生物防治手段控制番茄黃化曲葉病毒病的研究工作漸漸引起人們的關(guān)注和重視[5,6].

生防細(xì)菌是一類具有產(chǎn)生抗生素、抗腫瘤類藥物和蛋白酶等生物活性物質(zhì)潛力的微生物資源[7].利用其作為生防因子進(jìn)行植物病毒病的防治已成為生物防治的一種有效途徑，如RYU等[8]利用生防細(xì)菌沙雷氏菌90-166誘導(dǎo)擬南芥對(duì)黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)產(chǎn)生系統(tǒng)抗性，可明顯降低擬南芥病情指數(shù).WANG等[9]系統(tǒng)研究了芽胞桿菌誘導(dǎo)番茄對(duì)CMV的抗病作用，結(jié)果表明，芽胞桿菌對(duì)番茄植物具有明顯的系統(tǒng)誘導(dǎo)抗性，能誘導(dǎo)番茄植物中擴(kuò)張蛋白基因LeEXP2,LeEXP5和LeEXP18、調(diào)控基因NPR1以及防衛(wèi)基因PR1a的增強(qiáng)表達(dá).生防菌EBS05(CGMCC No.5239)是從樟樹周皮組織中分離的1株內(nèi)生枯草芽胞桿菌，該菌株具有較強(qiáng)的植物根際定殖能力，且對(duì)多種植物病原真菌和煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)具有穩(wěn)定的拮抗活性.前期研究結(jié)果顯示，內(nèi)生細(xì)菌EBS05所產(chǎn)生的脂肽類抗生素Surfactin A是誘導(dǎo)煙草對(duì)系統(tǒng)抗性的有效激發(fā)子[10].同時(shí)，EBS05對(duì)番茄植物具有明顯的促生作用，可有效誘導(dǎo)番茄對(duì)TYLCCV的系統(tǒng)抗性，誘導(dǎo)抗病性效果達(dá)53.60%[11].本研究測定了EBS05誘導(dǎo)番茄對(duì)TYLCCV系統(tǒng)抗性過程中，病程相關(guān)蛋白基因的誘導(dǎo)表達(dá)差異，以及番茄體內(nèi)β-1,3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶活性變化，為進(jìn)一步闡明內(nèi)生細(xì)菌EBS05的誘導(dǎo)抗性機(jī)理和新型抗病毒微生物農(nóng)藥的研發(fā)提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

內(nèi)生細(xì)菌EBS05由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)

院植物病害生物防治研究室分離、保存；供試植物材料番茄(江蔬14號(hào))和TYLCCV侵染性克隆，均由江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供；總RNA提取試劑TRIzol(美國Invitrogen公司)和反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)均購自寶生物工程(大連)有限公司.

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1 接種處理 將活化的侵染性克隆接種于LB培養(yǎng)基，28 ℃，170 r·min-1，振蕩培養(yǎng)16 h即為侵染性克隆接種液.接種處理時(shí)，選取長勢一致的5葉期番茄幼苗，用50 mL EBS05菌懸液(108cfu·mL-1)灌根處理，24 h后，用滅菌的牙簽蘸取TYLCCV侵染性克隆菌液，在番茄幼苗根基部針刺接種，處理后的番茄植株置于防蟲網(wǎng)隔離的溫室中自然生長.

1.2.2 EBS05誘導(dǎo)處理后番茄體內(nèi)病程相關(guān)蛋白基因檢測 選取長勢一致的5葉期番茄幼苗，分別做如下處理：① 50 mL EBS05菌懸液灌根處理1 d后接種TYLCCV(G1)；②50 mL EBS05菌懸液灌根處理1 d后用清水做接種處理(G2)；③ 50 mL清水灌根處理1 d后用清水做接種處理(CK).每組處理15株，3次重復(fù)；分別于接種后1，3，5和7 d，選取番茄幼苗生長點(diǎn)下第3片葉，采用RT-PCR分別測定PR1,PR2,PR3和PR5基因的相對(duì)表達(dá)量.總RNA的提取參照試劑RNA TRIzolRReagent，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以不同處理的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列如表1所示；PCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min.

1.2.3 EBS05誘導(dǎo)處理后番茄植株內(nèi)β-1,3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶活性的測定 選取長勢一致的5葉期番茄幼苗，分別做如下處理：① 50 mL清水灌根處理1 d后接種TYLCCV(T1)；② 50 mL EBS05菌懸液灌根處理1 d后用清水做接種處理(T2)；③ 50 mL EBS05菌懸液灌根處理1 d后接種TYLCCV(T3)；④ 50 mL清水灌根處理1 d后用清水做接種處理(CK).分別于接種處理后1，3，5，7，9，11，13和15 d，選取番茄幼苗生長點(diǎn)下第3片葉用于酶活性的測定，每組處理24株，3次重復(fù).β-1,3-葡聚糖酶活性和幾丁質(zhì)酶活性測定方法參照文獻(xiàn)[17,18].

表1 PCR擴(kuò)增引物Table 1 Primer Sequence for PCR

2 結(jié)果與分析

2.1EBS05誘導(dǎo)處理后番茄體內(nèi)病程相關(guān)蛋白基因的表達(dá)差異

試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，內(nèi)生細(xì)菌EBS05誘導(dǎo)處理及誘導(dǎo)處理后再挑戰(zhàn)接種TYLCCV時(shí)，番茄體內(nèi)PR1,PR2和PR3基因表達(dá)量均比對(duì)照顯著增加，而且呈逐漸增加的趨勢，并于接種處理后第7 d表達(dá)量最大.PR5基因在對(duì)照中未見表達(dá)，而EBS05誘導(dǎo)處理再接種TYLCCV后1 d，PR5基因被激活，并持續(xù)增量表達(dá)，而僅用EBS05誘導(dǎo)處理后，PR5基因從第3 d開始表達(dá)，至接種后3～7 d，PR5持續(xù)增量表達(dá)，其相對(duì)表達(dá)量低于接種TYLCCV處理.由此可見，內(nèi)生細(xì)菌EBS05誘導(dǎo)處理后，能誘導(dǎo)番茄體內(nèi)PR1、PR2和PR3基因的增量表達(dá)，同時(shí)，可有效激活番茄PR5基因的誘導(dǎo)表達(dá)，且在挑戰(zhàn)接種TYLCCV時(shí)，其誘導(dǎo)表達(dá)效果更加明顯.

處理1：EBS05誘導(dǎo)處理后接種TYLCCV；處理2：EBS05誘導(dǎo)處理后接種清水；對(duì)照：清水灌根處理后接種清水；M：DNA Marker；1，3，5，7分別代表接種后的天數(shù)G1:Inoculated with TYLCCV after treatment by EBS05; G2:Inoculated with water after treatment by EBS05; CK: Inoculated with water after treatment by water; M：DNA Marker；Number of 1, 3,5and 7 means days post inoculation, respectively圖1 不同處理后番茄體內(nèi)病程相關(guān)蛋白基因的表達(dá)Fig.1 Expression of pathogensis-related proteins genes in tomato plants after different treatments

2.2EBS05誘導(dǎo)處理對(duì)番茄植株內(nèi)β-1,3-葡聚糖酶活性的影響

內(nèi)生細(xì)菌EBS05誘導(dǎo)處理以及EBS05誘導(dǎo)處理再接種TYLCCV后，番茄體內(nèi)β-1,3-葡聚糖酶活性明顯升高，且呈先升高后下降的變化趨勢.接種處理后1～7 d，β-1,3-葡聚糖酶活性逐漸升高，并于第7 d達(dá)到活性峰值，接種處理后7～15 d，酶活性逐漸降低，但活性值均明顯高于對(duì)照健康植株.僅接種TYLCCV后，番茄體內(nèi)β-1，3-葡聚糖酶活性也呈先升高后降低的變化趨勢，但是酶活性明顯低于EBS05誘導(dǎo)后再接種TYLCCV處理.番茄植株感染TYLCCV后第11 d，β-1,3-葡聚糖酶活性低于對(duì)照健康植株(圖2).結(jié)合番茄黃化曲葉病毒病病程分析，番茄植株在僅接種TYLCCV后第9 d開始發(fā)病，接種后11～15 d為發(fā)病高峰，而EBS05誘導(dǎo)處理后，番茄黃化曲葉病毒病病害明顯減輕，發(fā)病時(shí)間延遲，僅在接種后第15 d才出現(xiàn)頂端葉片黃化和卷曲現(xiàn)象.由此可見，內(nèi)生細(xì)菌EBS05對(duì)番茄抗TYLCCV的誘導(dǎo)抗性效果與番茄體內(nèi)β-1，3-葡聚糖酶活性升高有一定的相關(guān)性.

T1：清水灌根處理后接種TYLCCV；T2：EBS05誘導(dǎo)處理后接種清水；T3：EBS05誘導(dǎo)處理后接種TYLCCV；CK：清水灌根處理后接種清水.

T1: Inoculated with TYLCCV after treatment by water; T2: Inoculated with water after treatment by EBS05; T3: Inoculated with TYLCCV after treatment by EBS05; CK: Inoculated with water after treatment by water.

圖2不同處理后番茄葉片內(nèi)β-1,3-葡聚糖酶活性的變化
Fig.2Changesofβ-1,3-glueanasintomatoleavesafterdifferenttreatments

2.3EBS05誘導(dǎo)處理對(duì)番茄植株內(nèi)幾丁質(zhì)酶活性的影響

試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，對(duì)照健康番茄植物體內(nèi)幾丁質(zhì)酶活性變化不大，而僅接種TYLCCV處理、內(nèi)生細(xì)菌EBS05誘導(dǎo)處理和EBS05誘導(dǎo)處理再接種TYLCCV后，番茄植株體內(nèi)幾丁質(zhì)酶活性均顯著高于對(duì)照健康植物，且呈現(xiàn)先升高后下降的變化趨勢，并于挑戰(zhàn)接種處理后第9 d達(dá)到活性峰值.EBS05誘導(dǎo)處理和EBS05誘導(dǎo)處理再接種TYLCCV后9～15 d，番茄體內(nèi)幾丁質(zhì)酶活性逐漸降低，但活性值均明顯高于僅接種TYLCCV處理和對(duì)照健康植物；僅接種TYLCCV處理9 d后，幾丁質(zhì)酶活性顯著降低，至15 d時(shí)，明顯低于對(duì)照健康植株.由此可見，內(nèi)生細(xì)菌EBS05誘導(dǎo)處理能有效提高番茄體內(nèi)幾丁質(zhì)酶活性，進(jìn)而提高番茄對(duì)TYLCCV的系統(tǒng)抗性.

T1：清水灌根處理后接種TYLCCV；T2：EBS05誘導(dǎo)處理后接種清水；T3：EBS05誘導(dǎo)處理后接種TYLCCV；CK：清水灌根處理后接種清水.

T1: Inoculated with TYLCCV after treatment by water; T2: Inoculated with water after treatment by EBS05; T3: Inoculated with TYLCCV after treatment by EBS05; CK: Inoculated with water after treatment by water.

圖3不同處理后番茄葉片內(nèi)幾丁質(zhì)酶活性的變化
Fig.3Changesofchitinaseintomatoleavesafterdifferenttreatments

3 討論

病程相關(guān)蛋白(Pathogensis-related proteins, PRPs)是指植物在受到病原物侵染或非生物因子誘導(dǎo)協(xié)迫條件下產(chǎn)生一類與植物抗性密切相關(guān)的水溶性蛋白.一般認(rèn)為，PRPs在植物病害系統(tǒng)中被誘導(dǎo)表達(dá)，并參與植物對(duì)病原物的防衛(wèi)反應(yīng)[19]，如蘇杭等[20]用丁香酚處理煙草后，誘導(dǎo)煙草體內(nèi)病程相關(guān)蛋白基因PR1,PR3和PR5表達(dá)，明顯提高了植株對(duì)TMV的抗病性.也有研究表明，PRPs在植物體內(nèi)為組成型表達(dá)，以維持植物對(duì)病原物的自然抗病性[21].從本研究結(jié)果來看，未經(jīng)接種處理的番茄體內(nèi)均可檢測出PR1,PR2和PR3基因的表達(dá)，內(nèi)生細(xì)菌EBS05誘導(dǎo)處理后，其表達(dá)量持續(xù)顯著增加，而PR5基因在未經(jīng)接種處理的番茄體內(nèi)未見表達(dá)，內(nèi)生細(xì)菌EBS05誘導(dǎo)處理后，PR5基因被激活，并持續(xù)增量表達(dá).由此可見，病程相關(guān)蛋白PR1,PR2和PR3在番茄體內(nèi)存在組成型表達(dá)，而PR5則屬于誘導(dǎo)性表達(dá).PR5蛋白又稱類甜蛋白(Thaumatin-like proteins, TLPs)，是植物自然免疫系統(tǒng)的組成之一[22].近年來，PR5蛋白因具有抗真菌活性和激活植物防衛(wèi)反應(yīng)信號(hào)途徑而倍受關(guān)注[23].現(xiàn)已在水稻、煙草、葡萄等多種植物真菌病害系統(tǒng)中被證實(shí)存在PR5蛋白的誘導(dǎo)性表達(dá)，并參與植物的防衛(wèi)反應(yīng)[24～26]，但尚未見PR5蛋白在番茄病毒病害系統(tǒng)中誘導(dǎo)表達(dá)，并誘導(dǎo)番茄對(duì)病毒侵染產(chǎn)生系統(tǒng)抗性的報(bào)道.本研究結(jié)果表明，內(nèi)生細(xì)菌EBS05可有效誘導(dǎo)番茄體內(nèi)PR5基因的表達(dá)，尤其是挑戰(zhàn)接種TYLCCV后，誘導(dǎo)表達(dá)效果更加明顯.該研究結(jié)果對(duì)基于轉(zhuǎn)PR5基因的番茄抗TYLCCV基因工程育種策略具有重要的參考價(jià)值.

目前，已鑒定的PRPs包括17個(gè)蛋白家族，其中，11個(gè)PRPs家族來自煙草和番茄植物[20].鑒于PRPs與植物抗病性密切相關(guān)，有關(guān)PRPs誘導(dǎo)合成的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及其在植物防衛(wèi)反應(yīng)中的功能已成為植物誘導(dǎo)抗性機(jī)理研究的重要內(nèi)容，其中，以PR1,PR2和PR3研究最為深入.在PRs家族中，PR1分布最廣泛、含量最高，約占植物葉片總蛋白的1%～2%，是植物防衛(wèi)反應(yīng)中最重要的功能蛋白之一，但目前對(duì)其功能尚不明確；PR2和PR3分別具有β-1,3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶活性，在植物抗真菌病害的防衛(wèi)反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，因此，基于上述3類病程相關(guān)蛋白基因的轉(zhuǎn)基因策略被廣泛應(yīng)用于植物抗病基因工程育種實(shí)踐，測定β-1,3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶活性也成為研究植物誘導(dǎo)抗病性效果的重要手段.本研究結(jié)果表明，內(nèi)生細(xì)菌EBS05誘導(dǎo)處理后1～7 d，β-1,3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶活性均顯著高于對(duì)照，且呈逐漸升高的趨勢，該結(jié)果與PR2和PR3基因在mRNA水平上的檢測結(jié)果一致.EBS05誘導(dǎo)處理能誘導(dǎo)番茄PR1,PR2和PR3基因增量表達(dá)，進(jìn)而增加PR1,PR2和PR3蛋白的積累，在防衛(wèi)反應(yīng)中，表現(xiàn)為β-1,3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶活性的持續(xù)升高.此外，菌株EBS05誘導(dǎo)處理番茄植物后，TYLCCV侵染癥狀明顯減輕，且發(fā)病時(shí)間延遲，由此可見，β-1,3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶活性與番茄對(duì)TYLCCV的誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性呈正相關(guān)，此研究結(jié)果與文獻(xiàn)的研究[27～29]結(jié)果一致.

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(責(zé)任編輯：朱秀英)

Pathogensis-relatedproteinsinducedbyendophyticbacteriaEBS05intomatoplant

LI Jun-zhou, ZHAO Yu-hua, WEN Cai-yi, ZANG Rui, ZHANG Jun

(College of Plant Protection, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China)

Genes expression of pathogensis-related proteins(PRPs) induced by endophytic bacteria EBS05 in tomato plant were investigated using var. Jiangshu 14 as test material, and the activities of β-1, 3-glueanas and chitinase were determined too. The results showed that strain EBS05 could induce the overexpression ofPR1,PR2 andPR3 genes, and activate the genePR5 to high level expression in tomato plant, thus increasing the systemic resistance to Tomato Yellow Leaf Curl Chinavirus(TYLCCV). The activities of β-1, 3-glueanas and chitinase in tomato plants inoculated with TYLCCV after pretreated by strain EBS05 were higher than those in the control plants, and the activity peak appeared at the 9thand 7thdays post inoculation, respectively. The increase of β-1, 3-glueanas and chitinase activities were positively correlated with the systemic resistance to TYLCCV in tomato plants mediated by strain EBS05 based on the pathogensis of TYLCCV-infected tomato plants.

endophytic bacteria; tomato yellow leaf curl China virus; induced resistance; pthogensis-related proteins

S 432.1

：A

2014-03-26

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31272083)；河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(13A210473)

李俊州，1990年生，男，河南柘城人，碩士研究生，從事植物病害生物防治研究工作.

文才藝，1965年生，男，湖北孝感人，教授，博士.

1000-2340(2014)05-0602-06