張 雷，強(qiáng) 勇，劉小龍，黃海嶸，劉燦輝，申 翼

0 引 言

肺癌是最常見且預(yù)后較差的惡性腫瘤之一，5年生存率低于15%［1］，是我國發(fā)病率、死亡率最高的惡性腫瘤［2－3］。研究和闡明肺癌的發(fā)生機(jī)制、尋找新的早期診斷指標(biāo)以降低其發(fā)病率非常重要［4－5］。目前許多相關(guān)研究都致力于尋找與肺癌發(fā)生機(jī)制相關(guān)的易感因素或抗性因素，特別是在流行病學(xué)方面已開展了廣泛的研究，并取得了顯著的進(jìn)展。近年來，國內(nèi)外學(xué)者已針對肺癌與 P450［6］、XRCC4［7］、M1［8］、HLA［9］、HSP70［10］、溶酶體相關(guān) 4次跨膜蛋白質(zhì) β 基因［11］、N-乙?；D(zhuǎn)移酶基因［12］、血管內(nèi)皮生長因子基因［13］等基因多態(tài)性之間的關(guān)系進(jìn)行了大量研究。雖然研究范圍很廣泛，但肺癌的發(fā)生機(jī)制仍未明確，促使我們尋找更多新的遺傳標(biāo)記作為研究手段，例如在群體遺傳學(xué)研究中應(yīng)用最為廣泛的短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeat，STR)在腫瘤發(fā)病機(jī)制方面的應(yīng)用仍處于起步階段。已有原發(fā)性胃腺癌［14］、食管癌［15］與STR 基因座相關(guān)性的研究報道，但在肺癌的發(fā)病風(fēng)險方面報道不多。

本研究將 D8S1179、D21S11、D7S820、CSF1PO、D3S1358、TH01、D13S317、D16S539、D2S1338、D19S433、vWA、TPOX、D18S51、D5S818、FGA 共 15 個 STR 基因座應(yīng)用于肺癌發(fā)病風(fēng)險的研究，通過病例組與對照組在15個STR基因座的等位基因頻率分布的差異性來推斷與肺癌發(fā)生相關(guān)的易感因素或抗性因素，為肺癌發(fā)生機(jī)制的研究提供一種新的途徑。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來源 病例組為2010年至2012年在我院門診就診及住院治療、經(jīng)病理切片證實、且取材前均未經(jīng)放射或者化學(xué)治療的120例肺癌患者，其中鱗癌63例，腺癌57例，年齡43～71歲，平均年齡(56.9±10.4)歲。對照組為南京及其周邊地區(qū)156例健康個體(經(jīng)細(xì)胞學(xué)檢查證實無異常，無肺癌及癌前病變，同時排除其他遺傳疾病)，所有研究對象均知情同意本項研究。分別采集病例組與對照組的外周靜脈血作為標(biāo)本，置于－80℃冰箱內(nèi)保存。

1.2 主要儀器和試劑 鼎永4800型擴(kuò)增儀、Gene-Amp PCR System 9700擴(kuò)增儀、ABI PRISM 3130XL遺傳分析儀、5%Chelex-100、Identifiler Plus?試劑盒。

1.3 方法

1.3.1 基因組DNA提取 參照 Walsh等［16］的方法，用5%Chelex-100提取病例組和對照組標(biāo)本的基因組DNA。

1.3.2 PCR擴(kuò)增 PCR試劑盒由美國Life Technologies公司提供。在同一反應(yīng)管中對15個基因座進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增。反應(yīng)體系為10 μL，其中 Mix預(yù)混液4μL，Primer set 2μL，dH2O 3μL，DNA 模板1μL。擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性11 min，然后94℃變性20 s，59℃退火3 min，共28個循環(huán)，最后60℃延伸10min，4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳與檢測 采用ABI 3130XL遺傳分析儀對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行自動毛細(xì)管電泳，Data Collection 2.1軟件收集電泳數(shù)據(jù)，GeneMapperID v3.2軟件分析擴(kuò)增產(chǎn)物片段長度并對等位基因進(jìn)行分型命名。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用Powerstats軟件(http://www.promega.com/geneticidtools/powerstats)計算病例組和對照組在15個STR基因座上的等位基因頻率和基因型頻率，并對病例組和對照組在15個STR基因座的基因型分布進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗。同時計算雜和度(heterozygosity，H)、多態(tài)信息含量(polymorphism information contents，PIC)、個體識別能力(power of discrimination，PD)、非父排除率(power of exclusion，PE)等多態(tài)性統(tǒng)計學(xué)指標(biāo)。采用SPSS 13.0軟件對每個基因座上的等位基因頻率分布進(jìn)行統(tǒng)計分析，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，以O(shè)R及其95%CI表示相對風(fēng)險度，OR大于1為有易感傾向，OR小于1為有抗性傾向［17］。

2 結(jié) 果

病例組與對照組之間在性別、吸煙狀況差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，在飲酒狀況上差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見表1。病例組與對照組在15個STR基因座的基因型頻率分布差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)，符合 Hardy-Weinberg平衡定律，見表 2。病例組與對照組在 CSF1PO、D19S433、D3S1358基因座的等位基因10、15.2、16差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜ 0.05)，OR 值分別為 1.482、1.673、1.467，均大于 1，見表 3。病例組與對照組在CSF1PO、D19S433 基因座的等位基因14、14.2 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，OR值分別為0.126和0.476，見表3。

表1 肺癌患者組與對照組的臨床特征Table 1 Clinical characteristics of the lung cancer patients and normal controls

表2 肺癌患者組與對照組STR基因座的多態(tài)性統(tǒng)計學(xué)指標(biāo)Table 2 Statistical indicators of the polymorphisms of the 15 STR loci in the lung cancer patients and normal controls

表3 肺癌患者組與對照組的肺癌發(fā)生相關(guān)易感等位基因和抗性等位基因統(tǒng)計學(xué)分析Table 3 Statistical analysis on lung cancer-related susceptive and resistant alleles in the lung cancer patients and normal controls

3 討 論

腫瘤的發(fā)生是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。吳建中等［18］的研究表明影響賁門癌發(fā)生發(fā)展的環(huán)境因素目前主要有吸煙、飲酒、飲茶等。而p53基因多態(tài)性則被證實與賁門癌的發(fā)生具有相關(guān)性［19］。一般我們認(rèn)為環(huán)境因素是腫瘤發(fā)生的始動因素，而個體的遺傳特征如腫瘤易感基因則決定其對腫瘤的易感性。腫瘤易感基因雖然不直接導(dǎo)致腫瘤發(fā)生，但可以影響癌基因和(或)抑癌基因的突變率［20］，從而影響個體對腫瘤的易感性。此類改變一般表現(xiàn)為個體某個基因在群體中的出現(xiàn)頻率上，因此對腫瘤的發(fā)病風(fēng)險進(jìn)行分子生物學(xué)研究時可以發(fā)生高頻改變的基因為出發(fā)點來比較腫瘤患者與健康人群在基因頻率上的差異。雖然目前的研究范圍很廣泛，但腫瘤的發(fā)生機(jī)制仍未明確，促使我們尋找更多新的遺傳標(biāo)記作為研究手段，例如群體遺傳學(xué)研究中應(yīng)用最為廣泛的STR基因座，其在人類基因組中廣泛存在，多態(tài)性豐富，且位于非編碼區(qū)，是分子生物學(xué)研究理想的遺傳標(biāo)記［21］，可用于基因作圖、定位克隆、疾病發(fā)生機(jī)制的關(guān)聯(lián)分析［22］。本研究中選取的15個STR基因座隨機(jī)分布在13條不同的染色體上，有利于隨機(jī)篩選，且突變率低，對照組與病例組在15個STR基因座上的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律。對照組在15個STR基因座的PD值介于0.768與0.959之間，PE值介于0.334與0.725 之間，PIC 值介于 0.540 與 0.840 之間，H值介于0.635與0.865之間，群體內(nèi)遺傳差異大，上述結(jié)果說明本研究選取的病例組與對照組均具有群體代表性。

由于STR基因座的等位基因頻率與人種、民族的遺傳背景關(guān)系明顯，因此在進(jìn)行病例-對照研究前需先建立本地區(qū)健康人群在選取的STR基因座上的等位基因頻率分布數(shù)據(jù)，進(jìn)而根據(jù)腫瘤患者與健康人群在上述STR基因座的等位基因頻率是否存在顯著性差異，篩選出與腫瘤發(fā)病風(fēng)險相關(guān)的易感因素或者抗性因素。否則，結(jié)果就會出現(xiàn)偏差。Climent等［23］研究了HLA-DRB1等位基因多態(tài)性與宮頸癌的關(guān)系，結(jié)果顯示等位基因15是與宮頸癌發(fā)病風(fēng)險相關(guān)的抗性因素。而在遼寧地區(qū)的宮頸癌患者中，等位基因15則是易感因素［24］，結(jié)論正好與Climent等［23］研究相反。

本研究首先采集南京地區(qū)健康個體的外周靜脈血樣作為對照組，并對其進(jìn)行STR分型，獲得等位基因頻率與基因型頻率，以此作為基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，再根據(jù)病例組與對照組中相關(guān)等位基因的出現(xiàn)頻率是否存在顯著性差異，從中篩選出與肺癌易感性或抗性相關(guān)的等位基因［25］，并用優(yōu)勢比(odds ratio)來近似的估計肺癌發(fā)生的相對危險度，即攜帶有特定等位基因的人與不攜帶此等位基因的人患有肺癌風(fēng)險的比值。實驗結(jié)果顯示，病例組與對照組在CSF1PO、D19S433、D3S1358 基因座的等位基因 10、15.2、16之間的頻率分布差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.044、0.034、0.034，OR=1.482、1.673、1.467)。例如CSF1PO基因座等位基因10的OR值為1.482，說明攜帶此等位基因的個體患肺癌的風(fēng)險是未攜帶此等位基因的個體的1.482倍，由此可以認(rèn)為CSF1PO基因座等位基因10可能是與肺癌發(fā)生相關(guān)的易感因素，其附近可能存在與肺癌發(fā)生相關(guān)的易感基因。結(jié)果同時顯示，病例組與對照組在 CSF1PO、D19S433基因座的等位基因14、14.2之間的頻率分布差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.020、0.007，OR=0.120、0.476)。例如CSF1PO基因座的等位基因14的OR值為0.126，說明攜帶此等位基因的個體患肺癌的風(fēng)險是未攜帶此等位基因的個體的0.126倍，由此可以認(rèn)為CSF1PO基因座等位基因14可能是與肺癌發(fā)生相關(guān)的抗性因素，其附近可能存在與肺癌發(fā)生相關(guān)的保護(hù)基因。

本研究中用于估計病因大小或暴露與疾病之間關(guān)聯(lián)強(qiáng)度的OR值的95%可信區(qū)間值均不包括1，說明病例組與對照組的差異有統(tǒng)計學(xué)意義［26］，反映了STR基因座應(yīng)用于腫瘤發(fā)病風(fēng)險研究的可行性。

本研究首次應(yīng)用STR基因座對與肺癌發(fā)生相關(guān)的易感因素和抗性因素進(jìn)行了初步研究。結(jié)果顯示，肺癌的發(fā)生是易感因素與抗性因素協(xié)同作用的結(jié)果。CSF1PO、D19S433、D3S1358基因座等位基因10、15.2、16是與肺癌發(fā)生相關(guān)的易感因素，可以加大肺癌的患病風(fēng)險。CSF1PO、D19S433基因座等位基因14、14.2是與肺癌發(fā)生相關(guān)的抗性因素，可以降低肺癌的患病風(fēng)險。另外，在本研究中尚未發(fā)現(xiàn)病例組與對照組在其他12個STR基因座的等位基因分布有顯著性差異，因此還需要在以后進(jìn)行大樣本、多地域、多民族廣泛深入的協(xié)同研究，探尋更多可能與肺癌發(fā)生相關(guān)聯(lián)的STR基因座，為進(jìn)一步深入探索肺癌的發(fā)生機(jī)制提供新的途徑。

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