林宇靜，郭瑞珍，王海青

0 引 言

細(xì)胞周期調(diào)控系統(tǒng)“Cyclins-CDKs-CKIs”由細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(Cyclin dependent kinases，CDK)、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制物(Cyclin dependent kinase inhibitors，CKI)共同構(gòu)成［1］，細(xì)胞周期的不同時(shí)相由不同的Cyclin控制，不同的Cyclin與不同的CDK結(jié)合形成復(fù)合物，促進(jìn)細(xì)胞由一個(gè)細(xì)胞階段向另一個(gè)細(xì)胞階段有序轉(zhuǎn)換，系統(tǒng)中CDK是細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的中心環(huán)節(jié)，其活性受CyclinD的正向調(diào)控，受CKI的負(fù)向調(diào)控［2］。執(zhí)行細(xì)胞周期G1/S期調(diào)控的Cyclin主要有Cyclin D1、D2，CDK 主要有 CDK4、CDK6，CKI有p21、p27等細(xì)胞因子。本文探討并報(bào)道細(xì)胞周期調(diào)控系統(tǒng)相關(guān)因子Cyclin D1-CDK4-p21在瘢痕癌中的表達(dá)和意義。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 標(biāo)本取自遵義醫(yī)學(xué)院病理教研室和中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院病理科2005-2011年石蠟包埋的標(biāo)本，分為瘢痕癌組、病理性瘢痕組和正常組。瘢痕癌組病例臨床均有病理性瘢痕形成史，病變部位分布在上肢、下肢和頭皮，從瘢痕形成到癌變的時(shí)間為2年到20年不等，癌的組織學(xué)類型均為鱗狀細(xì)胞癌;病理性瘢痕組患者臨床有皮膚燒傷或機(jī)械性創(chuàng)傷等損傷史，部位在下肢及胸腹部等處，瘢痕形成的時(shí)間為2個(gè)月至2年不等;正常皮膚組織取自臨床手術(shù)切除的帶有正常皮膚組織的病變標(biāo)本。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑 兔抗人Cyclin D1多克隆抗體，CDK4、p21單克隆抗體，均購自武漢博士德公司。CyclinD1 mRNA、CD4 mRNA和p21 mRNA寡核苷酸探針原位雜交試劑盒，購自武漢博士德公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法及步驟 所用組織均為4%甲醛固定，石蠟包埋，所用切片均為4 μm厚，撈片于處理過的防脫片上，60℃烤干，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1 免疫組化法 p21蛋白用乳腺癌組織作陽性對(duì)照，Cyclin D1、CDK4用結(jié)腸癌組織作陽性對(duì)照，以PBS代替一抗為陰性對(duì)照。切片常規(guī)脫蠟至水，微波抗原修復(fù)，操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行，經(jīng)DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水干燥、透明，中性樹膠封固。

1.3.2 原位雜交技術(shù) p21 mRNA用乳腺癌組織作陽性對(duì)照，CyclinD1 mRNA、CDK4 mRNA用結(jié)腸癌組織作陽性對(duì)照，滴加沒有探針的預(yù)雜交液為陰性對(duì)照。操作步驟按原位雜交試劑盒說明書進(jìn)行，每張切片分別滴加20 μL含CyclinD1 mRNA、CDK4 mRNA和p21 mRNA核苷酸探針雜交液，40℃雜交過夜，CyclinD1 mRNA用AEC顯色，其他2種指標(biāo)用DAB顯色，蘇木精復(fù)染，封固，光學(xué)顯微鏡觀察。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)判斷

1.4.1 免疫組化及原位分子雜交陽性表達(dá)定位判斷 DAB顯色陽性信號(hào)為棕黃色顆粒狀，AEC顯色陽性信號(hào)為紅色顆粒狀。Cyclin D1蛋白陽性信號(hào)位于細(xì)胞核，p21、CDK4蛋白及CyclinD1 mRNA陽性信號(hào)位于細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)，CDK4 mRNA、p21 mRNA陽性信號(hào)位于細(xì)胞質(zhì)。

1.4.2 免疫組化及原位分子雜交陽性等級(jí)判斷采用半定量積分法，根據(jù)每張切片的陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)和染色強(qiáng)度計(jì)分的乘積來判定［3］，＜2分為陰性，2～3分為弱陽性，4～6分為陽性，＞6分為強(qiáng)陽性。

1.4.3 免疫組化及原位分子雜交表達(dá)水平和表達(dá)強(qiáng)度判斷 運(yùn)用CCD成像系統(tǒng)，在400倍鏡下，每張切片選取10個(gè)不同視野成像，應(yīng)用顯微圖像分析系統(tǒng)分別檢測陽性染色的表達(dá)水平(陽性面積)和表達(dá)強(qiáng)度(平均光密度)，各取平均值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，定量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，各檢測指標(biāo)均采用單因素方差分析，兩兩比較采用最小顯著差異法，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。以P≤0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CDK4蛋白及其mRNA的表達(dá) 在正常皮膚表皮中，僅2例病例基底層細(xì)胞CDK4蛋白及其mRNA見弱陽性表達(dá);在病理性瘢痕被覆上皮中，陽性細(xì)胞數(shù)比正常皮膚表皮稍增多，均呈弱陽性表達(dá);在瘢痕癌組織中呈強(qiáng)陽性表達(dá)。見圖1、圖2。瘢痕癌組分別與正常皮膚組和病理性瘢痕組比較，CDK4蛋白及其mRNA表達(dá)水平、表達(dá)強(qiáng)度差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，但正常皮膚組與病理性瘢痕組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

2.2 CyclinD1蛋白及其mRNA的表達(dá) 分別檢測10例正常皮膚表皮、15例病理性瘢痕被覆上皮和25例瘢痕癌組織。Cyclin D1蛋白及其mRNA在正常皮膚表皮中，僅基底細(xì)胞層見少數(shù)弱陽性表達(dá)細(xì)胞;在病理性瘢痕上皮中弱陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)比正常皮膚表皮略顯增多;在瘢痕癌組織中呈強(qiáng)陽性表達(dá)，見圖3、圖4，瘢痕癌組分別與正常皮膚組和病理性瘢痕組比較，CyclinD1蛋白及其mRNA表達(dá)水平、表達(dá)強(qiáng)度差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，但正常皮膚組與病理性瘢痕組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。見表2。

2.3 p21蛋白及其mRNA的表達(dá) 分別檢測10例正常皮膚表皮，15例病理性瘢痕被覆上皮和30例瘢痕癌組織，p21蛋白及其mRNA在正常皮膚表皮和病理性皮膚瘢痕上皮中均呈陰性或弱陽性表達(dá);在瘢痕癌癌巢中呈強(qiáng)陽性表達(dá)，見圖5、圖6。瘢痕癌組與皮膚瘢痕組和正常皮膚組比較，p21蛋白及其mRNA表達(dá)水平、表達(dá)強(qiáng)度差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，但瘢痕組與正常皮膚組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表3。

2.4 相關(guān)性分析 經(jīng)過Pearson相關(guān)分析，瘢痕癌中CyclinD1與 CDK4(r=0.798，P ＜ 0.000 1)、p21 與CDK4(r=0.876，P ＜0.0001)的表達(dá)均呈正相關(guān)。

圖1 各組皮膚組織中CDK4蛋白的表達(dá)(IHC ×400)Figure 1 The expression of CDK4 protein(IHC×400)

圖2 各組皮膚組織中CDK4 mRNA的表達(dá)(ISH ×400)Figure 2 The expression of CDK4 mRNA(ISH×400)

表1 各組皮膚組織中CDK4蛋白及其mRNA的表達(dá)(±s)Table 1 The expression of CDK4 protein and CDK4 mRNA in different skin tissues(±s)

表1 各組皮膚組織中CDK4蛋白及其mRNA的表達(dá)(±s)Table 1 The expression of CDK4 protein and CDK4 mRNA in different skin tissues(±s)

與正常皮膚組比較，*P＜0.01;與病理性瘢痕組比較，#P＜0.01

組別 n CDK4蛋白的表達(dá)CDK4 mRNA 的表達(dá)平均光密度 陽性面積正常皮膚組 15 0.194 ±0.013 0.053 ±0.086 0.195 ±0.012 0.06平均光密度 陽性面積7 ±0.027病理性瘢痕組 15 0.214 ±0.026 0.061 ±0.014 0.235 ±0.021 0.080 ±0.032瘢痕癌組 15 0.273 ±0.024*# 0.159 ±0.036*# 0.281 ±0.033*# 0.207 ±0.039*#

表2 各組皮膚組織中CyclinD1蛋白及其mRNA的表達(dá)(±s)Table 2 The expression of CyclinD1 protein and mRNA in different skin tissues(±s)

表2 各組皮膚組織中CyclinD1蛋白及其mRNA的表達(dá)(±s)Table 2 The expression of CyclinD1 protein and mRNA in different skin tissues(±s)

與正常皮膚組比較，*P＜0.01;與病理性瘢痕組比較，#P＜0.01

組別 n CyclinD1蛋白的表達(dá)CyclinD1mRNA 的表達(dá)平均光密度 陽性面積正常皮膚組 10 0.039 ±0.095 0.169 ±0.012 0.049 ±0.083 0.17平均光密度 陽性面積9 ±0.022病理性瘢痕組 15 0.065 ±0.013 0.176 ±0.039 0.068 ±0.035 0.193 ±0.021瘢痕癌組 25 0.141 ±0.036*# 0.262 ±0.023*# 0.201 ±0.041*# 0.264 ±0.031*#

表3 各組皮膚組織中p21蛋白及其mRNA的表達(dá)(±s)Table 3 The expression of p21 protein and p21 mRNA in different skin tissues(±s)

表3 各組皮膚組織中p21蛋白及其mRNA的表達(dá)(±s)Table 3 The expression of p21 protein and p21 mRNA in different skin tissues(±s)

與正常皮膚組比較，*P＜0.01;與病理性瘢痕組比較，#P＜0.01

組別 n p21蛋白的表達(dá)p21 mRNA 的表達(dá)平均光密度 陽性面積正常皮膚組 10 0.052 ±0.020 0.197 ±0.036 0.072 ±0.044 0.20平均光密度 陽性面積3 ±0.024病理性瘢痕組 15 0.062 ±0.021 0.214 ±0.032 0.075 ±0.041 0.223 ±0.027瘢痕癌組 30 0.148 ±0.031*# 0.275 ±0.032*# 0.227 ±0.059*# 0.287 ±0.031*#

圖3 各組皮膚組織中Cyclin D1蛋白的表達(dá)(IHC ×400)Figure 3 The expression of Cyclin D1 protein(IHC×400)

圖4 各組皮膚組織中Cyclin D1 mRNA的表達(dá) (ISH ×400)Figure 4 The expression of Cyclin D1 mRNA(ISH×400)

圖5 各組皮膚組織中p21蛋白的表達(dá)(IHC ×400)Figure 5 The expression of p21 protein(IHC×400)

圖6 各組皮膚組織中p21mRNA的表達(dá)(ISH ×400)Figure 6 The expression of p21mRNA(ISH×400)

3 討 論

3.1 Cyclin D1與細(xì)胞周期調(diào)控 CyclinD是Ras-Raf-MAPK信號(hào)通路的下游靶基因，CyclinD的激活是細(xì)胞周期調(diào)控系統(tǒng)的始動(dòng)環(huán)節(jié)。Cyclin D包括了D1、D2、D3 3種類型，對(duì)Cyclin D1目前研究較為深入，Cyclin D1在細(xì)胞周期的G1早期表達(dá)增加，它與細(xì)胞中CDK4或CDK6結(jié)合形成復(fù)合物，通過Cyclin D1/CDK4或CDK6通路使細(xì)胞越過G1調(diào)控點(diǎn)，是細(xì)胞G1期到S期重要的調(diào)控因子［4］。研究表明，Cyclin D1在正常細(xì)胞周期的控制和腫瘤的發(fā)生中均發(fā)揮重要作用，Cyclin D1的過表達(dá)可激活 CDK4、CDK6的活性，縮短G1期，降低細(xì)胞增殖對(duì)有絲分裂原的依賴，使細(xì)胞周期調(diào)節(jié)失控和細(xì)胞異常增生，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生，故認(rèn)為Cyclin D1的異常表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)［5］。

3.2 瘢痕癌中Cyclin D1與CDK4的正調(diào)控作用Cyclins-CDKs-CKIs是真核細(xì)胞最重要的細(xì)胞周期調(diào)控系統(tǒng)，CDK是此系統(tǒng)的中心，Cyclin具有正性調(diào)控CDK的作用。在有生長因子的情況下，Cyclin D1在細(xì)胞周期中首先被合成，并于G1中期合成達(dá)到高峰，是G1期細(xì)胞增殖信號(hào)的關(guān)鍵蛋白質(zhì)，CDK4/6蛋白的含量及活化程度在細(xì)胞增殖周期由G1向S期過渡過程中起限速作用［6-7］，兩者結(jié)合成復(fù)合物，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程。其異常表達(dá)可致細(xì)胞增殖失控，腫瘤發(fā)生。有研究表明，黑色素瘤、前列腺癌、惡性淋巴瘤等腫瘤中有 CDK4或 CDK6的過表達(dá)，或有Cyclin D1和CDK4的同時(shí)過表達(dá)［8-9］，這些研究提示CDK與Cyclin在腫瘤組織中的表達(dá)成正性調(diào)控關(guān)系，它們的高表達(dá)具有促癌作用。我們的研究表明，病理性Cyclin D1及其mRNA、CDK4及其mRNA在瘢痕癌組中均呈強(qiáng)陽性表達(dá)，其表達(dá)水平、表達(dá)強(qiáng)度明顯高于正常皮膚組和病理性瘢痕組，說明在瘢痕癌中既有Cyclin D1的高表達(dá)，也有CDK4的高表達(dá);既有蛋白水平的高表達(dá)也有分子水平的高表達(dá)。相關(guān)性分析:Cyclin D1與CDK4的表達(dá)均呈正相關(guān)關(guān)系(正向調(diào)控)，提示在瘢痕癌中，在細(xì)胞周期G1/S期轉(zhuǎn)換過程中，Cyclin D1并非是一個(gè)促進(jìn)細(xì)胞周期的獨(dú)立執(zhí)行基因，它需要與CDK結(jié)合形成復(fù)合物而發(fā)揮作用，促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化?？傃灾：郯┲蠧yclin D1與CDK4表現(xiàn)為一種正向調(diào)控，Cyclin D1可能是通過與CDK4結(jié)合形成復(fù)合物，促進(jìn)細(xì)胞周期G1/S期轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致細(xì)胞異常增生，瘢痕癌發(fā)生。瘢痕癌有可能是一種細(xì)胞周期性疾病。

3.3 瘢痕癌中p21與CDK的負(fù)調(diào)控作用 p21作為CKI家族成員之一，是目前已知具有最廣泛激酶抑制活性的細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，具有抑癌作用。在細(xì)胞周期調(diào)控系統(tǒng)中p21為負(fù)性調(diào)控因子，通過對(duì)CDK起抑制作用，促進(jìn)DNA的損傷修復(fù)，保證遺傳信息的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性，同時(shí)與PCNA結(jié)合抑制DNA復(fù)制，抑制腫瘤的發(fā)生。一旦p21表達(dá)降低或消失，則失去對(duì)CDK及其復(fù)合物蛋白激酶活性的正常調(diào)節(jié)，影響細(xì)胞增殖與分化的調(diào)控，導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生。根據(jù)這一論點(diǎn)，我們認(rèn)為p21在瘢痕癌組織中預(yù)期結(jié)果應(yīng)該是呈低表達(dá)，與Cyclin-CDK的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(負(fù)向調(diào)控)。事實(shí)是:在瘢痕癌組織中p21蛋白及其mRNA呈強(qiáng)陽性表達(dá)，而且p21的表達(dá)與Cyclin D1、CDK4表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系，與瘢痕癌細(xì)胞增殖呈正向調(diào)控。這與預(yù)期結(jié)果不相吻合，分析其原因可能有:①有研究表明，p21在不同腫瘤組織如在胃癌、肺癌、鼻咽癌細(xì)胞株等惡性腫瘤中表現(xiàn)為缺失或表達(dá)下降，對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖呈負(fù)向調(diào)控作用［10-11］，而在皮膚鱗狀細(xì)胞癌癌、食管鱗狀細(xì)胞癌等惡性腫瘤中p21表現(xiàn)為高表達(dá)，對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的正向調(diào)控作用［12-13］。我們在瘢痕癌研究中也獲得高表達(dá)的結(jié)果，提示 p21在腫瘤組織中的表達(dá)可能具有組織特異性，皮膚鱗狀細(xì)胞癌、食管鱗狀細(xì)胞癌和瘢痕癌的組織來源都與鱗狀上皮有關(guān)，提示在這一類型腫瘤中，負(fù)向調(diào)控CDK的有可能是CKI家族的其它成員。②通過 siRNA技術(shù)封閉KLF6基因表達(dá)，可以導(dǎo)致Cyclin D1/CDK4蛋白的結(jié)合能力增加，提示Cyclin D1/CDK4復(fù)合物的活性還受到KLF6的調(diào)控。KLF6又稱Kruppel樣因子6，是一種腫瘤抑制基因產(chǎn)物，能與Cyclin D1連接，并降低Cyclin D1/CDK4復(fù)合物的活性［14］，提示Cyclin D1-CDK4復(fù)合物活性的抑制調(diào)控可能還有CKI家族以外的其他抑制調(diào)控因子參與。③有研究報(bào)道，p21在腫瘤組織中的異常高表達(dá)，可能還應(yīng)考慮p21與p53基因突變之間的關(guān)系，在胃癌細(xì)胞中p53基因無突變者p21高表達(dá)，而p53基因有突變者p21低表達(dá)［15］，p21的表達(dá)呈 p53依賴性，其高表達(dá)可能與p53基因無突變有關(guān)。④p21除了具有抗凋亡的功能外，也具有促進(jìn)凋亡的雙重功能，Kralj等［16］用腺病毒載體導(dǎo)入外源性p21基因到4株腫瘤細(xì)胞中，結(jié)果p21過表達(dá)引起其中2株細(xì)胞凋亡的發(fā)生。說明p21具有促進(jìn)凋亡的功能。本組瘢痕癌中p21高表達(dá)，是否發(fā)揮了促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，其確切關(guān)系有待進(jìn)一步探討。目前，由于p21在腫瘤細(xì)胞中的抗凋亡功能，使其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用變得備受爭議。綜上所述，瘢痕癌中p21與CDK的負(fù)調(diào)控作用，有可能是由CKI家族的其他成員或者由CKI家族以外的其他抑制調(diào)控因子來執(zhí)行，有待進(jìn)一步探討。

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