王瑩 劉玉剛 陳占法

腦組織代謝旺盛，血流量豐富，因此腦缺血極易引起神經(jīng)細(xì)胞損害，致功能缺失。缺血、缺氧條件下，神經(jīng)元產(chǎn)生大量自由基，同時(shí)鈣離子(Ca2+)超載，損傷線粒體，從而誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡［1］。梓醇是一種環(huán)烯醚菇類的小分子化合物。研究表明，能促進(jìn)PC12細(xì)胞軸突生長(zhǎng)、保護(hù)海馬神經(jīng)元等［2，3］。文獻(xiàn)報(bào)道連二亞硫酸鈉聯(lián)合無(wú)糖Earle’s液損傷模型能較好地反映神經(jīng)細(xì)胞缺糖缺氧損傷［4］，本研究以PC12細(xì)胞為基礎(chǔ)建立該模型，考察梓醇的干預(yù)作用，并從拮抗自由基損傷和減輕Ca2+超載探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞(PC12)購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù);梓醇購(gòu)自上海同田生物技術(shù)公司，純度≥97%;連二亞硫酸鈉、RPMI1640培養(yǎng)基、噻唑藍(lán)MTT、胎牛血清均為 Gibco公司產(chǎn)品;乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒購(gòu)自南京建成生物公司。

1.2 方法

1.2.1 PC12細(xì)胞培養(yǎng)及分組:PC12細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基。細(xì)胞經(jīng)0.05%胰蛋白酶消化傳代后置含5%CO2的37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)共分5組:正常對(duì)照組:不加任何藥物;缺糖、缺氧損傷組:加入終濃度含0.5 mmol/L連二亞硫酸鈉的無(wú)糖Earle’s液;梓醇高、中、低劑量組:梓醇終濃度分別為 10、1、0.1μmol/L，各濃度梓醇預(yù)處理細(xì)胞24 h后，加入連二亞硫酸鈉損傷，1 h后進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)。

1.2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率:細(xì)胞以1×105個(gè)/ml接種于96孔板，每孔100μl。12 h后，按照實(shí)驗(yàn)分組給予處理。檢測(cè)時(shí)每孔加5 mg/ml MTT溶液15μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清后每孔加入150μl DMSO，振蕩10 min，用酶標(biāo)儀在492 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔吸光度值(OD值)。細(xì)胞存活率(%)=處理組OD值/對(duì)照組OD值×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 乳酸脫氫酶(LDH)漏出率檢測(cè):細(xì)胞以4×105個(gè)/ml接種于24孔板，每孔500μl。12 h后，按照實(shí)驗(yàn)分組給予處理。檢測(cè)時(shí)，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。LDH釋放率(%)=上清LDH活性/(上清LDH活性+細(xì)胞溶解液LDH活性)×100%。

1.2.4 SOD、GSH-Px活性及MDA含量測(cè)定:細(xì)胞以4×105個(gè)/ml接種于24孔板，每孔500μl。12 h后，按照實(shí)驗(yàn)分組給予處理。檢測(cè)時(shí)，收集細(xì)胞，超聲裂解后低溫離心，取上清液按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定SOD、GSH-Px活性及MDA含量。

1.2.5 細(xì)胞內(nèi)游離 Ca2+濃度測(cè)定［5，6］:細(xì)胞以 7 ×104個(gè)/ml接種于25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，每瓶5 ml。12 h后，按照實(shí)驗(yàn)分組給予處理。檢測(cè)時(shí)，收集細(xì)胞，應(yīng)用基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行漂洗，加入1μmol/L Fura-2/AM，37℃避光恒溫震蕩45 min，漂洗，于雙波長(zhǎng)熒光分光光度計(jì)上340 nm和380 nm處測(cè)F值，分別加入Triton X-100和EGTA，測(cè)F最大值(Fmax)及最小值(Fmin)。Ca2+=Kd(R-Rmin)/(Rmax-R)(Fmin/Fmax)。其中Kd是Fura-2與Ca2+的解離常數(shù)，為224 nmol/L;R=F340/F380。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PC12細(xì)胞生存率 與正常對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞生存率顯著降低(P＜0.01);與模型組比較，梓醇1μmol/L組、10μmol/L組細(xì)胞生存率顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。見(jiàn)表1。

表1 梓醇對(duì)PC12細(xì)胞生存率影響n=9，%，±s

表1 梓醇對(duì)PC12細(xì)胞生存率影響n=9，%，±s

注:與正常對(duì)照組比較，*P＜0.01;與模型組比較，#P＜0.01

生存率正常對(duì)照組組別100模型組 46.8±1.9*梓醇0.1μmol/L組 49.1±3.6梓醇1μmol/L組 60.8±1.5#梓醇10μmol/L組 71.0±1.5#

2.2 LDH漏出率 與正常對(duì)照組比較，模型組LDH漏出率顯著升高(P＜0.01);與模型組比較，梓醇可劑量依賴性的降低LDH漏出率(P＜0.05或＜0.01)。見(jiàn)表2。

2.3 SOD、GSH-Px的活性及MDA含量 與正常對(duì)照組比較，缺糖缺氧損傷降低了細(xì)胞上清SOD、GSH-Px的活性(P ＜0.01)，而MDA含量顯著升高(P ＜0.01)。與模型組比較，梓醇1μmol/L組、10μmol/L組可劑量依賴性的升高SOD活性(P＜0.01)，升高GSH-Px活性(P ＜0.05或＜0.01)，梓醇10μmol/L組可降低MDA含量(P ＜0.05)。見(jiàn)表3。

表2 梓醇對(duì)PC12細(xì)胞LDH漏出率影響

表3 梓醇對(duì)PC12細(xì)胞SOD、GSH-Px活性及MDA含量影響

2.4 細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度 與正常對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度顯著增加(P＜0.01)。與模型組比較，梓醇可劑量依賴性的降低細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度(P ＜0.05或 ＜0.01)。見(jiàn)表4。

表4 梓醇對(duì)PC12細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度影響

3 討論

PC12細(xì)胞為大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤克隆化的細(xì)胞株，具有較典型的神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞特征，已廣泛用于細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)與細(xì)胞內(nèi)信使、興奮性神經(jīng)毒性和神經(jīng)保護(hù)機(jī)制的研究［7，8］。

缺血產(chǎn)生的腦細(xì)胞損傷在本質(zhì)上主要是腦組織氧、糖缺乏而引發(fā)的一系列事件的結(jié)果。體外常用缺氧低糖培養(yǎng)引起神經(jīng)細(xì)胞損傷模擬腦缺血模型［9］。實(shí)驗(yàn)中主要選擇性的去除具有至關(guān)重要作用的葡萄糖以代表缺血所致的低營(yíng)養(yǎng)條件。加入連二亞硫酸鈉清除培養(yǎng)基質(zhì)中的氧而達(dá)到使細(xì)胞發(fā)生化學(xué)性缺氧的目的，研究表明，含0.5 mmol/L連二亞硫酸鈉的無(wú)糖Earle’s液與PC12細(xì)胞共培養(yǎng)1 h，細(xì)胞活力下降。梓醇預(yù)給藥24 h，能減輕缺糖、缺氧對(duì) PC12細(xì)胞的損傷。

正常情況下LDH存在于細(xì)胞液中，一旦細(xì)胞膜通透性升高，即釋放到細(xì)胞外，因此LDH釋放是細(xì)胞膜通透性升高的一種標(biāo)志性蛋白［10］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，缺糖、缺氧導(dǎo)致PC12細(xì)胞膜通透性增加，LDH大量釋放。梓醇可劑量依賴性的減少細(xì)胞LDH的漏出，表明梓醇對(duì)缺糖、缺氧致細(xì)胞損傷具有一定的保護(hù)作用。

正常代謝產(chǎn)生的自由基可被體內(nèi)相應(yīng)的自由基清除酶如SOD，GSH-Px及時(shí)清除，這對(duì)于保護(hù)細(xì)胞不受毒性氧自由基損傷有重要作用［11］。腦缺血再灌注時(shí)，產(chǎn)生大量氧自由基、激活興奮性氨基酸NMDA受體、促使內(nèi)源性谷氨酸大量釋放而引發(fā)神經(jīng)毒性，同時(shí)氧自由基防御系統(tǒng)功能受損，影響SOD、GSH-Px的活性，機(jī)體清除氧自由基的能力減弱，因此，測(cè)定SOD、GSHPx活性不僅可反映神經(jīng)細(xì)胞損傷的原因，而且還可以判斷細(xì)胞損傷的程度［12］。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)中的重要產(chǎn)物，測(cè)定MDA生成可反映細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的程度，間接反映氧自由基生成的情況以及細(xì)胞損傷的程度［13］。因此，我們分別檢測(cè)了SOD、GSH-Px及MDA在細(xì)胞中的活性及含量變化。

本實(shí)驗(yàn)表明，細(xì)胞損傷后，SOD、GSH-Px活性顯著下降，MDA含量顯著升高，表明缺血再灌注后氧自由基清除能力下降，氧自由基生成增加，脂質(zhì)過(guò)氧化程度加劇，提示所致細(xì)胞損傷與氧化損傷有關(guān)。缺血前加入梓醇，可劑量依賴性提高細(xì)胞中SOD、GSH-Px活性，降低MDA含量。提示梓醇可降低細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，提高細(xì)胞清除超氧陰離子的能力，從而發(fā)揮抗自由基損傷的作用。

Ca2+是神經(jīng)細(xì)胞信息傳遞的重要第二信使，對(duì)于維持神經(jīng)細(xì)胞正常代謝與功能起著重要的調(diào)控作用。細(xì)胞缺氧時(shí)，神經(jīng)元產(chǎn)生大量自由基，細(xì)胞線粒體功能障礙，能量供應(yīng)不足，鈣泵不能主動(dòng)把細(xì)胞內(nèi)的Ca2+泵出細(xì)胞外，由于ATP不足，糖酵解代償性增強(qiáng)，使細(xì)胞內(nèi)［Ca2+］i升高，導(dǎo)致細(xì)胞Ca2+超載，啟動(dòng)一系列病理生理機(jī)制，造成細(xì)胞損傷或死亡［14，15］。同時(shí)，Ca2+超載又會(huì)加重自由基的產(chǎn)生。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)已表明Ca2+在缺血缺氧性腦損傷中起著重要的作用［16］。本實(shí)驗(yàn)也顯示，缺血缺氧神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量明顯高于正常對(duì)照組，說(shuō)明PC12細(xì)胞在缺血缺氧的情況下，細(xì)胞膜受到損傷，其通透性發(fā)生了改變，出現(xiàn)了Ca2+內(nèi)流。梓醇可顯著降低受損PC12細(xì)胞內(nèi)的Ca2+含量，抑制Ca2+內(nèi)流，維持胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)平衡;提示其有可能通過(guò)抑制細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載而對(duì)缺血缺氧損傷的PC12起到一定的保護(hù)作用。

綜上所述，梓醇對(duì)連二亞硫酸鈉誘導(dǎo)的缺糖缺氧細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，該作用可能與其清除自由基和抑制鈣超載有關(guān)。

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