佘臘枝，魯海濤，謝 瓊（湖北省荊州市中心醫(yī)院耳鼻喉科 434020）

鼻息肉的發(fā)生與局部微環(huán)境控制下的中鼻道和鼻竇黏膜反復(fù)、長(zhǎng)期慢性炎癥有關(guān)［1］。嗜酸性粒細(xì)胞（EOS）局部浸潤(rùn)及其所導(dǎo)致的繼發(fā)性炎癥是目前公認(rèn)的與鼻息肉發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的致病因素。因此，以EOS為代表的炎性細(xì)胞的聚集和活化成為鼻息肉發(fā)病機(jī)制研究的重要內(nèi)容。缺氧誘導(dǎo)因子－1α（HIF－1α）作為一種重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在機(jī)體適應(yīng)低氧環(huán)境的過(guò)程中具有重要作用，而且與鼻息肉的發(fā)生也密切相關(guān)［2］。基質(zhì)金屬蛋白酶－9（MMP－9）能降解基膜中的Ⅳ型膠原，可能通過(guò)降解血管基膜細(xì)胞參與鼻息肉組織中的EOS浸潤(rùn)過(guò)程［3］。本研究分析了鼻息肉組織中HIF－1α和 MMP－9的表達(dá)及與EOS浸潤(rùn)的關(guān)系，旨在探討鼻息肉的發(fā)病機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2010年10月至2012年12月于本院耳鼻咽喉科住院的行鼻內(nèi)窺鏡手術(shù)治療的鼻息肉患者31例（觀察組），男18例、女13例，年齡36～60歲，平均（43.7±6.5）歲；根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)耳鼻咽喉科學(xué)分會(huì)制訂的慢性鼻竇炎鼻息肉臨床分型、分期標(biāo)準(zhǔn)，31例患者中，2型Ⅰ期患者4例、2型Ⅱ期患者16例、2型Ⅲ期患者8例、3型患者3例［4］。同期于本院因下鼻甲肥大而需手術(shù)部分切除下鼻甲黏膜組織的慢性肥厚性鼻炎患者11例（對(duì)照組），男7例、女4例，年齡33～59歲，平均（42.5±6.2）歲。所有患者術(shù)前1個(gè)月內(nèi)均未使用糖皮質(zhì)激素、類固醇藥物以及抗組胺類藥物。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 組織標(biāo)本采集 鼻息肉患者及慢性肥厚性鼻炎患者均于術(shù)中采集鼻息肉組織標(biāo)本或下鼻甲黏膜組織。組織標(biāo)本于4%甲醛溶液中固定，常規(guī)脫水，制成石蠟塊后保存。

1.2.2 反轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)（RT－PCR）測(cè)定HIF－1α和MMP－9的表達(dá) 通過(guò)引物設(shè)計(jì)、總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄及PCR擴(kuò)增獲得PCR產(chǎn)物，將其置入凝膠成像分析儀中，在254nm紫外線下照相，分析電泳條帶光密度值及光密度比值，以半定量的方式分析HIF－1α和 MMP－9mRNA的表達(dá)。

1.2.3 免疫組織化學(xué)染色 取石蠟塊連續(xù)切片，參照試劑盒（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）說(shuō)明書進(jìn)行HIF－1α和MMP－9免疫組織化學(xué)染色。采用盲法閱片，由2位病理科醫(yī)生在不知曉患者臨床及病理資料的情況下進(jìn)行閱片和結(jié)果判斷。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)紫紅色顆粒或鮮紅色顆粒時(shí)判為陽(yáng)性。在高倍光鏡下（×400）隨機(jī)選擇5個(gè)視野，分別計(jì)數(shù) HIF－1α和 MMP－9陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量；在中倍光鏡下（×200）隨機(jī)選擇5個(gè)視野，分別計(jì)數(shù)存在HIF－1α和MMP－9陽(yáng)性細(xì)胞血管的數(shù)量。

1.2.4 蘇木素－伊紅染色法測(cè)定EOS 取石蠟塊連續(xù)切片，進(jìn)行蘇木素－伊紅常規(guī)染色。細(xì)胞質(zhì)中存在大量鮮紅色顆粒的細(xì)胞判為EOS。在高倍光鏡下（×400）隨機(jī)選擇5個(gè)視野，計(jì)數(shù)EOS的數(shù)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson分析。P＜0.05為比較差異或統(tǒng)計(jì)參數(shù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HIF－1α和 MMP－9mRNA表達(dá)水平比較兩組患者HIF－1α和MMP－9mRNA表達(dá)水平見(jiàn)表1。與對(duì)照組相比，觀察組 HIF－1α和 MMP－9mRNA水平明顯升高（P＜0.05）。

表1 HIF－1α和 MMP－9mRNA表達(dá)水平比較（）

表1 HIF－1α和 MMP－9mRNA表達(dá)水平比較（）

注：－表示無(wú)數(shù)據(jù)。

組別 n HIF－1α 11 7.61±1.47 5.72±1.13觀察組 31 16.32±3.61 14.25±2.89 t－20.23 14.33 P－＜0.05 ＜MMP－9對(duì)照組0.05

2.2 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果分析 鼻息肉組織鏡下可見(jiàn)HIF－1α多分布于上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、腺體細(xì)胞和多種炎性細(xì)胞中；MMP－9主要分布于上皮細(xì)胞、腺體細(xì)胞及多種炎性細(xì)胞中。下鼻甲黏膜組織中僅可見(jiàn)極少量棕色細(xì)胞。觀察組HIF－1α和MMP－9陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)、陽(yáng)性血管數(shù)及EOS浸潤(rùn)數(shù)均高于對(duì)照組（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 細(xì)胞及血管計(jì)數(shù)結(jié)果比較（，個(gè)／高倍鏡）

表2 細(xì)胞及血管計(jì)數(shù)結(jié)果比較（，個(gè)／高倍鏡）

注：－表示無(wú)數(shù)據(jù)。

組別 n陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)HIF－1α EOS 浸潤(rùn)數(shù)MMP－9陽(yáng)性血管數(shù)HIF－1αMMP－9.12±0.78觀察組 31 10.67±3.18 29.47±8.62 3.89±1.28 2.46±0.75 8.75±2.11 t－15.25 13.88 10.77 6.84 15.44 P－＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜對(duì)照組 11 1.61±0.63 6.61±2.17 1.22±0.36 1.33±0.37 2 0 .05

2.3 Pearson相關(guān)性分析結(jié)果 Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，觀察組HIF－1α和MMP－9陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與EOS浸潤(rùn)數(shù)呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.56、0.88（P＜0.05）。

3 討 論

鼻息肉是多種因素作用下形成的鼻黏膜炎性病變，是耳鼻咽喉頭頸外科常見(jiàn)病，病因尚未完全闡明。近年來(lái)，鼻腔內(nèi)鼻道血流供應(yīng)不足所引起的鼻息肉缺血、缺氧狀態(tài)，以及該狀態(tài)促進(jìn)血管生成在鼻息肉發(fā)病過(guò)程中的作用逐漸引起了學(xué)者們的關(guān)注［5］。

HIF－1α是缺氧狀態(tài)下廣泛存在于人體內(nèi)的一種異源二聚體逆轉(zhuǎn)錄因子，是調(diào)控細(xì)胞供氧平衡和誘導(dǎo)缺氧基因表達(dá)的重要蛋白之一［6］。缺氧條件下，細(xì)胞上調(diào) HIF－1α的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)下游靶向基因的轉(zhuǎn)錄以適應(yīng)微環(huán)境的改變，減少細(xì)胞凋亡。有研究表明，下調(diào) HIF－1α基因的表達(dá)，可抑制巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞在低氧環(huán)境下參與炎癥的能力，從而防止炎癥的發(fā)生。康健等［7］采用免疫組織化學(xué)染色法和原位雜交等方法，檢測(cè)了人鼻黏膜上皮細(xì)胞HIF－1α表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在鼻息肉組織中存在著大量的HIF－1α陽(yáng)性細(xì)胞。本研究結(jié)果顯示，與慢性肥厚性鼻炎患者下鼻甲黏膜組織相比，鼻息肉組織HIF－1αmRNA水平明顯升高，HIF－1α陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)、陽(yáng)性血管數(shù)和EOS浸潤(rùn)數(shù)也更高（P＜0.05），表明 HIF－1α在鼻息肉組織中的表達(dá)水平明顯增高，與上述文獻(xiàn)報(bào)道相符。

MMP－9是目前已知的活性最強(qiáng)的MMP家族成員，能有效降解基膜和明膠中的Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型膠原，過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)和血管基膜加速降解［8］。MMP－9參與了細(xì)胞浸潤(rùn)、腎小球硬化、間質(zhì)纖維化等多種病理、生理過(guò)程，可能在多種炎癥性疾病和惡性腫瘤發(fā)病過(guò)程中起到重要作用。Wang等［9］研究發(fā)現(xiàn)，與正常組大鼠比較，變應(yīng)性鼻炎大鼠模型鼻黏膜組織MMP－9及1型組織基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑（TIMP－1）表達(dá)水平明顯增高，黏膜下腺體增生明顯（P＜0.05）。Lalaker等［10］研究發(fā)現(xiàn)，鼻息肉組織MMP－9表達(dá)水平和活化程度與正常鼻黏膜組織的比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明 MMP－9在鼻息肉組織生長(zhǎng)過(guò)程中起到重要作用。本研究結(jié)果顯示，鼻息肉組織MMP－9mRNA水平明顯高于下鼻甲黏膜組織，且鼻息肉組織MMP－9陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與EOS浸潤(rùn)數(shù)呈正相關(guān)（P＜0.05），與上述研究報(bào)道一致，說(shuō)明 MMP－9在鼻息肉發(fā)病機(jī)制中起著重要作用。

綜上所述，HIF－1α和 MMP－9均在鼻息肉發(fā)病機(jī)制中具有非常關(guān)鍵的作用，但二者的具體作用部位及機(jī)制尚需進(jìn)一步研究以證實(shí)。可以預(yù)見(jiàn)，以HIF－1α和MMP－9作為治療靶點(diǎn)，通過(guò)抑制HIF－1α和 MMP－9的表達(dá)以減緩鼻息肉細(xì)胞的生長(zhǎng)，可能成為鼻息肉治療和預(yù)防的重要手段。

［1］林海，林董，陳賢明，等.缺氧誘導(dǎo)因子－1α與碳酸酐酶Ⅸ在鼻息肉組織中的表達(dá)及相關(guān)性分析［J］.臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2010，24（17）：776－778.

［2］汪際云，渡邊荘，松倉(cāng)聡，等.雙鏈RNA對(duì)人鼻息肉上皮細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶mRNA表達(dá)的影響［J］.中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2010，45（3）：229－232.

［3］崔珂，康健，柴麗，等.HIF－1α及IL－5在鼻息肉組織中的表達(dá)及意義［J］.山東醫(yī)藥，2010，50（36）：58－59.

［4］郭斌.鼻息肉中 MMP－2、MMP－9的表達(dá)及意義［D］.西寧：青海大學(xué)，2012.

［5］王佳.HIF－1α、STAT3及Survivin在鼻息肉中的表達(dá)及意義［D］.河南：鄭州大學(xué)，2012.

［6］賈曉琳，康健，陳冬，等.基質(zhì)蛋白酶－9和白細(xì)胞介素－8在鼻息肉中的表達(dá)及其意義［J］.廣東醫(yī)學(xué)，2011，32（12）：1579－1581.

［7］康健，曲亞榮，陳冬，等.缺氧誘導(dǎo)因子－1α及嗜酸粒細(xì)胞趨化因子在鼻息肉組織中的表達(dá)及意義［J］.中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2010，13（9）：3043－3045.

［8］王麗燕，張冬梅.鼻腔鱗狀細(xì)胞癌組織中 MMP－2、MMP－9、TIMP－1、TIMP－2的表達(dá)變化及意義［J］.山東醫(yī)藥，2013，53（3）：74－75.

［9］Wang H，Zhang R，Wu J，et al.Knockdown of neurokinin－1receptor expression by small interfering RNA prevents the development of allergic rhinitis in rats［J］.InflammRes，2013，62（10）：903－910.

［10］Lalaker A，Nkrumah L，Lee WK，et al.Chitin stimulates expression of acidic mammalian chitinase and eotaxin－3by human sinonasal epithelial cells in vitro［J］.Am J Rhinol Allergy，2009，23（1）：8－14.