于 淼，于 洋，劉林濤

(1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與環(huán)境科學(xué)研究中心，哈爾濱150076;2.國(guó)家教育部抗腫瘤天然藥物工程研究中心，哈爾濱150076;3.哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥物研究所博士后科研流動(dòng)站，哈爾濱150076)

生物堿(alkaloid)廣泛存在于自然界中，是一類(lèi)堿性的含氮有機(jī)化合物，大多數(shù)生物堿含有復(fù)雜的氮環(huán)結(jié)構(gòu)，如吡啶，吲哚，喹啉，嘌呤等，也有少數(shù)是胺類(lèi)化合物.石蒜堿屬于異喹啉類(lèi)生物堿中的吡咯駢菲里啶生物堿.石蒜堿是中草藥中具有顯著藥理活性的重要化學(xué)成分，研究發(fā)現(xiàn)石蒜堿具有抑制乙酰膽堿酯酶、催吐、鎮(zhèn)靜、陣痛、抗腫瘤等多種生物活性，因此具有很高的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值［1－3］.本文對(duì)石蒜堿誘導(dǎo)人慢性髓原白血病K562細(xì)胞凋亡及膜電位進(jìn)行了研究，以探討其抗腫瘤的作用機(jī)制.

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞

K562細(xì)胞株由哈爾濱商業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與環(huán)境科學(xué)研究中心提供.

1.2 試劑及藥品

石蒜堿(質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%)，阿拉丁試劑有限公司;羥基喜樹(shù)堿(質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%)，哈爾濱圣泰藥業(yè);胎牛血清(FCS)，杭州四季青生物工程公司;溴化四氮唑藍(lán)(MTT)，Sigma公司;碘化丙啶(PI)，Angus公司;TritonX－100，F(xiàn)arco公司;枸櫞酸鈉，北京化學(xué)試劑公司;羅丹明123(Rh123)，碧云天公司.

1.3 儀器

CO－150型CO2培養(yǎng)箱，日本三洋公司;680型酶標(biāo)儀，美國(guó)Bio－Rad公司;CLOUTER EPICSXL流式細(xì)胞儀，美國(guó)Beckman－Coulter公司;SP2激光共聚焦掃描顯微鏡，德國(guó)Leica公司.

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 試劑配制

石蒜堿:稱(chēng)取10 mg石蒜堿并溶于10 mL PBS中配制成1 mg/mL的母液，避光4℃保存.用無(wú)血清的1640培養(yǎng)液配制成所需的質(zhì)量濃度.

羥基喜樹(shù)堿:母液質(zhì)量濃度為1 mg/mL，4℃避光保存.給藥前以1640培養(yǎng)液稀釋到所需質(zhì)量濃度即可.

1640培養(yǎng)液:將一袋1640粉末倒入大燒杯中，加雙蒸水定容至1 L，待充分?jǐn)嚢枞芙夂蠹尤?.5gNaOH，調(diào)整 pH 到 7.2 左右，用 0.22μm微孔濾膜過(guò)濾2次，加入已過(guò)濾的胎牛血清(水浴56℃，30 min滅活)，使血清終體積分?jǐn)?shù)為10%，封口膠封口，4℃保存.

PBS 緩沖液:精密稱(chēng)取 0.1gKCl、4.0gNaCl、0.1gKH2PO4、1.78gNa2HPO4加入雙蒸水溶解并定容至500mL，121℃，高壓滅菌30min，用封口膜封口，4℃保存.

MTT溶液:避光稱(chēng)取MTT粉末50mg，用PBS緩沖液溶解，定容到100 mL，用微孔濾膜(0.22 μm)過(guò)濾，封口膜封口，4℃避光保存.

三聯(lián)溶解液:稱(chēng)取SDS粉末10g，異丁醇5mL，10mol/L HCl0.1 mL用雙蒸水溶解配成100 mL溶液.

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

從5%CO2，37℃的培養(yǎng)箱中取出K562細(xì)胞，在顯微鏡下進(jìn)行觀察.當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80%左右的高密度時(shí)，即可進(jìn)行細(xì)胞傳代.800 r/min離心去掉到離心管中的培養(yǎng)液，吸取3 mLPBS洗滌1次.取出新培養(yǎng)瓶加入適量的含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液，按1∶6或適當(dāng)比例轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)瓶中，將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)［4］.

2.3 MTT法測(cè)定石蒜堿對(duì)K562細(xì)胞的細(xì)胞毒作用

取處于對(duì)數(shù)期的K562細(xì)胞，將細(xì)胞懸液調(diào)整為5×104個(gè)/mL，接種于96孔板當(dāng)中，每孔加入100μL的細(xì)胞懸液，然后每孔加入100μL的石蒜堿，終質(zhì)量濃度依次為:0.25、1、4、16 μg/mL，每劑量設(shè)6個(gè)平行孔;陰性組加入相同體積的培養(yǎng)液;陽(yáng)性對(duì)照組加入100μL羥基喜樹(shù)堿，終質(zhì)量濃度為5μg/mL，置于37℃，含5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)中培養(yǎng)72 h后，每孔加入200μL新鮮配制含0.5 mg/mL MTT，持續(xù)培養(yǎng)2～4 h，每孔加150 μL三聯(lián)裂解液溶解，用微型振蕩器進(jìn)行振蕩混勻10 min，用酶標(biāo)儀檢測(cè)確定光密度值(OD值)，參考波長(zhǎng)490 nm，檢測(cè)波長(zhǎng)570 nm.用下面公式計(jì)算藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率，并按中效方程計(jì)算IC50［5］.細(xì)胞抑制率% =(空白對(duì)照組 OD值－給藥組平均OD值)/空白對(duì)照組平均OD值×100%

2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)石蒜堿誘導(dǎo)K562細(xì)胞的凋亡率

取處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的人慢性髓原白血病K562細(xì)胞，收集細(xì)胞，然后細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整濃度為1.0×105個(gè)/mL接種于6孔板中，放入7℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁后，給藥，石蒜堿的終濃度分別為5、10、20μg/mL，陽(yáng)性藥羥基喜樹(shù)堿終濃度為5μg/mL.繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞，1 600 r/min離心10 min，棄上清液，每個(gè)離心管中加入1 mL PBS進(jìn)行洗滌并離心后，棄上清液，加入70%冰乙醇－20℃固定過(guò)夜.PBS洗1次，加入配好的 PI染液(含 PI 50 mg/mL、RNase 1 g/L、0.1%TritonX －100)，避光室溫染色30 min，300目尼龍網(wǎng)過(guò)濾后上機(jī)檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng) 525 nm，檢測(cè)細(xì)胞數(shù)為 104個(gè)［6－7］，見(jiàn)圖 1.

2.5 激光共聚焦檢測(cè)K562細(xì)胞中線粒體膜電位變化的影響

取在生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的人慢性髓原白血病K562細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/mL接種于6孔培養(yǎng)板中，每孔1 mL放入37℃，5%CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待對(duì)數(shù)期后，加入不同質(zhì)量濃度的石蒜堿，使其終質(zhì)量濃度為 2.5、5、10 μg/mL.陽(yáng)性藥羥基喜樹(shù)堿的終質(zhì)量濃度為2μg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，加入羅丹明123染色.37℃孵育1 h.孵育結(jié)束后，1 500 r/min離心10 min，棄上層清液，收集細(xì)胞，用PBS洗滌1次.重懸細(xì)胞后，取200μL，激光共聚焦掃描顯微鏡觀察線粒體膜電位熒光強(qiáng)度(FI)，激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為 540 ～570 nm［8－9］，見(jiàn)圖 2.

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)石蒜堿對(duì)K562細(xì)胞的凋亡率

2.6 數(shù)據(jù)處理

用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.數(shù)據(jù)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±S)表示，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析.P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

3 結(jié)果與分析

3.1 石蒜堿對(duì)K562細(xì)胞的細(xì)胞毒作用

MTT法觀察石蒜堿對(duì)人慢性髓原白血病K562細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，選取5個(gè)不同濃度的藥物分別作用72 h后，計(jì)算得出石蒜堿IC50值為0.049 μmol/L，羥基喜樹(shù)堿 IC50值為 0.011 μmol/L，見(jiàn)表1.

圖2 石蒜堿作用48 h染色K562細(xì)胞線粒體膜電位變化

表1 MTT法測(cè)定72 h石蒜堿對(duì)K562細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用

3.2 石蒜堿對(duì)K562細(xì)胞凋亡率的影響

人慢性髓原白血病K562細(xì)胞經(jīng)過(guò)石蒜堿作用48 h后，細(xì)胞出現(xiàn)凋亡的亞二倍體峰，抑制了DNA的合成.經(jīng)計(jì)算得出凋亡率分別為(10.94±1.52)%、(15.29±2.02)%、(19.05±2.36)%，有顯著性差異(P＜0.01)，劑量越大凋亡率越高.見(jiàn)表2.

表2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)石蒜堿對(duì)K562細(xì)胞的凋亡率(x±S)

3.3 石蒜堿對(duì)－562細(xì)胞膜電位的影響

激光共聚焦掃描顯微鏡檢測(cè)不同濃度的石蒜堿作用K562細(xì)胞72 h后細(xì)胞內(nèi)的線粒體膜電位(Δψm).圖2中，峰高表示熒光強(qiáng)度的高低，而熒光強(qiáng)度的高低間接的反映出線粒體膜電位的高低.給藥組的熒光強(qiáng)度隨給藥劑量的增加而降低，且呈一定的劑量依賴(lài)關(guān)系.由表3可知，陰性對(duì)照組熒光強(qiáng)度為(75.67±1.15)，低、中、高三個(gè)給藥組熒光強(qiáng)度分別為(37.56±1.46)、(29.48±1.22)和(17.61±2.16)，陽(yáng)性藥對(duì)照組為(19.29±0.97).與陰性對(duì)照組相比都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，且隨著給藥劑量增大，熒光強(qiáng)度降低越為顯著.

表3 石蒜堿對(duì)K562(x±S)

4 討論

本文采用MTT比色法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)石蒜堿對(duì)K562細(xì)胞具有一定的細(xì)胞毒作用，并且能夠抑制K562細(xì)胞的增殖.用流式細(xì)胞儀分析經(jīng)PI染色后的細(xì)胞懸液，可以發(fā)現(xiàn)在DNA直方圖上正常二倍體細(xì)胞的G0/G1峰前會(huì)出現(xiàn)一個(gè)亞二倍體峰(即AP峰－apoptoticpeak)，此峰代表凋亡的細(xì)胞群體.根據(jù)此亞二倍體峰可以計(jì)算凋亡細(xì)胞占整個(gè)樣品的百分率.結(jié)果顯示，石蒜堿作用于K562細(xì)胞72 h后，DNA直方圖上有明顯凋亡峰出現(xiàn)，凋亡率隨給藥劑量的增加而升高，說(shuō)明石蒜堿對(duì)K562細(xì)胞的抑制作用與細(xì)胞凋亡有關(guān)［8－9］.

膜電位下降發(fā)生在凋亡的早期階段，即細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變之前.通過(guò)抑制ΔΨm的下降可以阻止凋亡的發(fā)生，說(shuō)明細(xì)胞ΔΨm變化為凋亡的特異性改變.陽(yáng)離子親脂熒光素Rhodamine123能擴(kuò)散到線粒體基質(zhì)中，被線粒體選擇性吸收，其擴(kuò)散量能反映Ψm的變化.實(shí)驗(yàn)采用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察在不同濃度石蒜堿作用72 h后線粒體膜電位的變化.結(jié)果顯示陰性對(duì)照組細(xì)胞熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，即膜電位最高;陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞熒光強(qiáng)度最弱，即膜電位最低;給藥組熒光強(qiáng)度隨給藥劑量升高而減弱，這說(shuō)明與陰性對(duì)照組相比，膜電位依給藥劑量升高而降低，且呈一定的劑量依賴(lài)關(guān)系.即是說(shuō)石蒜堿能夠?qū)е翶562細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位明顯下降.線粒體膜電位的降低說(shuō)明線粒體膜通透性已經(jīng)發(fā)生改變.在該過(guò)程中，一旦線粒體膜電位損耗，細(xì)胞就會(huì)進(jìn)入無(wú)法挽回的凋亡過(guò)程.但目前石蒜堿誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡的機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步研究.

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