盧暉+夏建兵+翁黎明+李鋼++張榮+王兆平

摘 要 目的：探討c-Myc、k-Ras、p16蛋白在膽囊癌細胞中的表達及臨床意義。方法：收集20例膽囊癌、50例慢性膽囊炎和20例正常膽囊組織標本，用免疫組化法檢測c-Myc、k-Ras、p16蛋白的表達，分析三種蛋白表達與膽囊癌的臨床病理特征關系。結果：c-Myc、k-Ras蛋白定位于細胞質和細胞核中，在膽囊癌中的表達程度明顯高于慢性膽囊炎和正常膽囊，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。p16定位于胞質，在膽囊癌中的表達程度明顯低于正常膽囊和慢性膽囊炎，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。c-Myc表達程度與腫瘤大小、分化和淋巴結轉移密切相關（P<0.05）；k-Ras表達程度與腫瘤大小、侵犯深度和淋巴結轉移密切相關（P<0.05）。結論：c-Myc、k-Ras、p16蛋白在膽囊癌細胞中呈異常表達，其表達與臨床病理特征相關，可能在膽囊癌發(fā)生發(fā)展中起有重要作用。

關鍵詞 膽囊腫瘤 c-Myc k-Ras p16 病理特征

中圖分類號：R735.8 文獻標識碼：A 文章編號：1006-1533（2014）18-0027-03

Expressions of c-Myc， k-Ras and p16 protein in gallbladder carcinoma cells and its clinical implication

LU Hui， XIA Jianbing， WENG Liming， LI Gang， ZHANG Rong， WANG Zhaoping

（Department of General Surgery of Fengcheng Hospital， the Ninth Peoples Hospital of the Medical School of Jiao Tong University， Shanghai 201411， China）

ABSTRACT Objective： To investigate the expressions of c-Myc， k-Ras and p16 protein in the gallbladder carcinoma cells and their clinical implication. Methods： The expressions of c-Myc， k-Ras and p16 protein were detected in 20 cases of gallbladder carcinoma， 50 cases of chronic cholecystitis and 20 cases of normal gallbladder tissue specimens with the immunohistochemical method. The relationships of the expressions of three kinds of proteins with the clinical pathological characteristics were assayed. Results： The c-Myc and k-Ras expressions were localized in the cytoplasm and nucleus of tumor cells， and the expressions in gallbladder carcinoma were significantly higher than those in chronic cholecystitis and the normal gallbladder， whose difference had the statistical significance （P<0.01）. The location of p16 protein was found in the cytoplasm. The expression degrees in the gallbladder carcinoma were obviously lower than those in the normal gallbladder and chronic cholecystitis， whose difference had the statistic significance （P<0.01）. The expression degree of c-Myc was significant correlation with the size of the tumor， poor differentiation， and lymphatic metastasis （P<0.05）. The expression degree of k-Ras was significant correlation with the size of the tumor， depth of invasion， and lymphatic metastasis （P<0.05）. Conclusion： The expressions of c-Myc， k-Ras， and p16 protein present abnormal in the gallbladder carcinoma cells and their expressions are correlated with the clinical pathological characteristics which may probably play an important role in the occurrence and development of the gallbladder carcinoma.

KEY WORDS gallbladder carcinoma； c-Myc； k-Ras； p16； pathological characteristicsendprint

原發(fā)性膽囊癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，轉移早，預后差[1-2]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展與多種原癌基因如c-Myc、k-Ras的激活及抑癌基因p16失活密切相關。膽囊癌的發(fā)病因素研究也表明慢性膽囊炎與膽囊癌發(fā)生密切相關[3]。目前，c-Myc、k-Ras 與p16蛋白在膽囊癌中的表達與膽囊癌的發(fā)生發(fā)展關系尚不明確。本研究探討c-Myc、k-Ras、p16蛋白表達與膽囊癌的臨床病理特征關系，為揭示膽囊癌的發(fā)生發(fā)展機制提供理論依據(jù)。

材料與方法

臨床資料

收集上海交通大學附屬第九人民醫(yī)院奉城分院2010年3月-2013年3月行膽囊癌根治術20例患者的膽囊癌標本，其中男8例，女12例，年齡50～82歲，平均58.6歲。同時收集慢性膽囊炎患者50例和正常膽囊者20例（復旦大學附屬中山醫(yī)院肝移植供肝捐贈）的膽囊標本。

研究方法

膽囊癌組織按UICC標準分級及TNM分期，采用SP法檢測c-Myc、k-Ras及p16在膽囊癌、慢性膽囊炎和正常膽囊細胞中的表達。標本置4%甲醛溶液中固定12 h，脫水、透明、浸蠟，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，操作按試劑盒說明書進行。兔抗人c-Myc、k-Ras及p16多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，工作濃度1：50。用同一指標陽性切片作陽性對照，PBS代替一抗作陰性對照。

結果判定

c-Myc、k-Ras及p16蛋白表達以胞質中或胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒為顯色。染色結果根據(jù)染色強度和陽性細胞面積進行半定量分析。染色強度：棕褐色為3分，棕黃色為2分，淺黃色為1分，不著色為0分。陽性細胞面積計算：陽性細胞占總面積≤10%為0分，11%～25%為1分，26%～50%為2分，≥51%為3分。兩項指標相加分數(shù)分為4級：0～1分“-”；2分為“+”；3～4分為“++”；5～6分為“+++”。 “-”和“+”為陰性；“++”和“+++”為陽性。設置陽性和陰性對照以保證染色結果的可靠性。

統(tǒng)計學處理

采用SPSS12.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

c-Myc、k-Ras 、p16蛋白表達

在膽囊癌細胞中c-Myc和k-Ras染色均一（圖1c、圖2c），雖然在正常膽囊和慢性膽囊炎細胞也可見染色，但顏色普遍較淺（圖1a、1b， 圖2a、2b）。在正常膽囊細胞中p16染色均一（圖3a），在慢性膽囊炎細胞中染色較淺（圖3b），而在膽囊癌細胞中則呈弱表達（圖3c）。

c-Myc、k-Ras、p16表達與臨床病理特征關系

c-Myc、k-Ras表達與膽囊癌患者年齡、性別、腫瘤位置無關（P>0.05），而c-Myc表達與腫瘤大小、分化和淋巴結轉移密切相關（P<0.05）；k-Ras表達與腫瘤大小、侵犯深度和淋巴結轉移密切相關（P<0.05，表1）。

討論

c-Myc是myc原癌基因族中的一員，定位于人染色體8q24。c-myc癌基因轉錄產(chǎn)生的mRNA，由細胞核轉入細胞質，翻譯成c-Myc蛋白。細胞受生長因子刺激或c-myc癌基因被異常激活后，c-Myc蛋白的表達明顯升高，引起細胞增殖，同時抑制與分化有關的基因表達，降低細胞的終末分化。Crozo等[4]發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌發(fā)病中c-Myc引起的細胞周期調控異常是較晚期的分子事件，在乳腺浸潤性癌組織中發(fā)現(xiàn)c-Myc基因擴增，而在乳腺良性和正常組織中未有發(fā)現(xiàn)，說明c-Myc基因過度表達可能參與了腫瘤的發(fā)生、進展過程。在本研究中，c-Myc蛋白在正常膽囊、炎癥性膽囊均呈弱表達，而在膽囊癌中表達明顯增高，說明在膽囊癌的演變過程中c-Myc基因可能被激活，導致細胞周期增殖失控。

k-Ras定位于染色體12p11.1-p12.1，基因產(chǎn)物為ras-21蛋白，具有三磷酸鳥苷酶活性，并能與GTP結合。點突變激活的ras基因所表達的rasp21蛋白的GTP酶活性降低，使p21蛋白與GTP結合時間延長，對細胞產(chǎn)生持續(xù)性刺激，使細胞產(chǎn)生持續(xù)增殖和惡性轉化，在控制細胞生長和分化中起重要作用。劉海林等[5]通過MASA方法檢測血漿DNA中k-Ras基因第12密碼子的突變，結果在7例膽囊癌中，5例k-Ras基因突變陽性（71.4%）。k-Ras基因為原癌基因，在正常組織中可有一定表達，k-Ras基因經(jīng)過突變以后，在組織中出現(xiàn)異常表達。Dobrzycka等[6]報道k-Ras基因陽性表達率在腫瘤組織中增加。在本研究中，k-Ras蛋白在正常膽囊和炎癥性膽囊中均有表達，但在膽囊癌中表達明顯上升，提示k-Ras癌基因激活是膽囊癌發(fā)生的重要因素。

p16蛋白為細胞周期素依賴性激酶（CDK）的抑制蛋白。近來研究認為，細胞周期失調是癌變的重要原因。p16蛋白能與CDK4結合，抑制CDK4/周期蛋白D復合物的催化活性，從而阻止細胞從G1期進入S期，抑制細胞增殖，在腫瘤的發(fā)生過程中起負性調節(jié)作用[7]。已發(fā)現(xiàn)在很多腫瘤中有p16基因的缺失和p16蛋白表達水平下降，提示p16基因的改變與很多人類惡性腫瘤的發(fā)病機制有關。本研究中p16蛋白在膽囊癌細胞的表達明顯低于慢性膽囊炎和正常膽囊細胞，提示在膽囊癌發(fā)生過程中發(fā)生p16失活。

綜上所述，本研究中c-Myc、k-Ras蛋白表達與膽囊癌的惡性表型TNM分期、分化程度、淋巴結轉移密切相關，進一步證實c-Myc、k-Ras蛋白的過表達參與了膽囊癌的發(fā)展，提示可作為術后預測膽囊癌患者復發(fā)與轉移的重要指標。

參考文獻

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Crozo C， Corominas JM， Tusquets I， et al. The MYC oncogene in breast cancer progression： from benign epithelium to invasive carcinoma[J]. Cancer Genet Cytogenet， 2006， 165（2）： 151-156.

劉海林， 渡邊弘之， 澤武紀雄. 血漿K-ras基因突變檢測對膽道系統(tǒng)癌的診斷意義[J]. 臨床肝膽病雜志， 2000， 16（3）： 164-166.

Dobrzycka B， Terlikowski SJ， Mazurek A， et al. Circulating free DNA， p53 antibody and mutations of KRAS gene in endometrial cancer[J]. Int J Cancer， 2010， 127（3）： 612-621.

Hu B， Jarzynka MJ， Guo P， et al. Angiopoietin 2 induces glioma cell invasion by stimulating matrix metalloprotease 2 expression through the alphavbeta1 integrin and focal adhesion kinase signaling pathway[J]. Cancer Res， 2006， 66（2）： 775-783.

（收稿日期：2014-07-12）endprint