何利兵，武 江，張培勝，孔 佳，李文玲，趙文清

難治性癲癇是指臨床對抗癲癇藥物治療反應差的部分癲癇患者，即兩種一線藥物規(guī)治療2年以上仍有癲癇發(fā)作。顳葉癲癇為臨床最常見的難治性部分性癲癇類型，顳葉癲癇占難治性癲癇的60%～70%［1］。顳葉癲癇的手術治療效果已經(jīng)得到認可，但手術患者的預后仍存在差異，部分患者手術后仍不能得到很好的改善，如何能夠早期判斷手術的預后具有重大的臨床意義。

縫隙連接（gap junction，GJ）是多種生理功能包括電偶聯(lián)，細胞間信息傳遞的結(jié)構(gòu)基礎［2］，縫隙連接蛋白（connexin，Cx）是構(gòu)成縫隙連接通道的基本功能蛋白，細胞內(nèi)的離子和小分子物質(zhì)可借此出入相鄰細胞，在神經(jīng)細胞的生長、分化以及生理功能的調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用［3］。成年哺乳類動物腦組織中表達最強的是Cx43，主要在星形膠質(zhì)細胞中表達［4］。研究發(fā)現(xiàn)Cx43可能和癲癇的電傳導具有密切的關系，但與顳葉癲癇預后的關系研究較少。本研究就顳葉癲癇手術患者的Cx43表達和手術預后情況進行分析。

1 資料與方法

1.1 患者篩選 回顧性分析2009年6月—2012年6月經(jīng)河北省人民醫(yī)院功能神經(jīng)外科進行術前評估和手術治療的顳葉癲癇病例43例，篩選顳葉皮層組織標本完整，隨訪資料完善的患者納入試驗組，如果診斷存在爭議或者合并存在其他疾病，則排除不進入研究。隨訪方法包括進行門診、電話、信件隨訪。對患者進行隨訪后，根據(jù)患者癲癇發(fā)作情況按照Engel標準分級：Ⅰ級，無影響功能癲癇發(fā)作（除外術后早期的癲癇發(fā)作）；Ⅱ級，僅有稀少的影響功能的癲癇發(fā)作；Ⅲ級，癲癇發(fā)作得到相當?shù)母纳疲虎艏?，癲癇發(fā)作改善不明顯［5］。

1.2 免疫組化流程 應用SP法，按照兔抗人Connexin43單克隆抗體（SAB公司，濃度1∶100）試劑說明書進行，制作好的免疫組化切片在Olympus光學顯微鏡下高倍鏡進行定性觀察。按照參考文獻報道，Cx43在胞漿和胞膜均有表達，判定胞漿和胞膜染成棕黃色為陽性細胞。每張切片隨機選取5個視野，PT彩色病理圖像分析系統(tǒng)在400倍高倍鏡下測量Cx43免疫反應陽性細胞數(shù)目。

1.3 統(tǒng)計學處理 全部數(shù)據(jù)使用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件處理，計量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組間比較用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般資料 經(jīng)篩選后，符合條件者45例，男31例，女14例，年齡14歲～52歲（26.6歲±11.8歲），病程2年～25年，平均9.7年。單純部分性發(fā)作27例，復雜部分性發(fā)作39例，全面性發(fā)作10例，復雜部分繼發(fā)全面強直陣攣性發(fā)作23例，失神發(fā)作1例。所有患者術前均長期服用過數(shù)種抗癲癇藥物，如丙戊酸鈉、卡馬西平、氯硝西泮、拉莫三嗪、左乙拉西坦等，平均用藥時間5.2年，符合難治性癲癇診斷標準。所有患者術前均行長程視頻腦電圖檢查，42例監(jiān)測到臨床及腦電圖發(fā)作，腦電圖均有異常發(fā)現(xiàn)，多為高波幅陣發(fā)性或單發(fā)棘波、尖波，部分患者出現(xiàn)棘慢波復合波。

所有患者均在全身吸入靜脈復合麻醉下手術，以術前腦電圖及影像學檢查結(jié)果為依據(jù)，行擴大翼點開顱，手術操作均在顯微鏡下完成，均行標準顳葉切除術，包括前顳葉、部分海馬等內(nèi)側(cè)結(jié)構(gòu)。術中應用皮層腦電圖監(jiān)測，均可監(jiān)測出尖波或棘波，將病灶切除后再次進行皮層腦電圖監(jiān)測，直至無明顯放電為止。術后常規(guī)應用抗癲癇藥物，主要以卡馬西平為主，平均用量為900 mg／d。

2.2 隨訪結(jié)果 本組患者隨訪1年～4年，平均2.2年。術后療效按Engel標準評定，EngelⅠ級30例（66.7%），Ⅱ級9例（20.0%），Ⅲ 級4例（8.9%），Ⅳ級2例（4.4%）。效果優(yōu)良（EngelⅠ＋ Ⅱ級）39例（86.7%），效果不佳 （EngelⅢ＋ Ⅳ級）為6例（13.3%）。

2.3 免疫組織化學觀察 應用免疫組化方法檢測Cx43在大腦皮層中的星形膠質(zhì)細胞明顯表達，以胞漿或突起染成棕黃色為陽性。在手術效果良好組中平均每個視野Cx43免疫反應陽性細胞為11.48個±4.36個，在手術效果不佳組中，平均每個視野Cx43免疫反應陽性細胞為27.64個±3.78個，陽性細胞增多明顯高于手術效果良好組（P＜0.05）。

3 討 論

縫隙連接為細胞膜上的一種特殊結(jié)構(gòu)，構(gòu)成相鄰細胞間的通道，信息離子及小分子可經(jīng)其進行細胞間轉(zhuǎn)運，是目前認為細胞間直接交換物質(zhì)和信息的通道，是細胞間電突觸的結(jié)構(gòu)基礎［2］?？p隙連接既存在于同種類型細胞之間，也存在于不同類型的細胞之間，其中中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)數(shù)量最多的星形膠質(zhì)細胞之間具有最廣泛的縫隙連接，這種結(jié)構(gòu)也構(gòu)成了大腦內(nèi)廣泛的信息傳遞網(wǎng)絡系統(tǒng)。眾多研究發(fā)現(xiàn)縫隙連接在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的電活動的維持、同步化放電以及生長發(fā)育等諸多方面，都起著重要的作用，癲癇的電生理改變是大腦神經(jīng)元出現(xiàn)異常的、過度的同步性放電，提示縫隙連接也可能在癲癇的發(fā)病機制方面扮演著重要的角色。

縫隙連接蛋白是構(gòu)成縫隙連接通道的基本功能蛋白，每6個跨膜的蛋白亞基圍繞中央孔排列形成一個連接小體，相鄰細胞膜上的連接小體對接形成縫隙連接［5］。在細胞間通道形成前，半通道呈關閉狀態(tài)，而當相鄰細胞的半通道連接時，在細胞間形成直徑約1.5 nm的通道，細胞內(nèi)的離子和小分子物質(zhì)可借此出入相鄰細胞。目前，縫隙連接蛋白是由多基因家族編碼的一大類膜蛋白，由許多成員組成，在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的連接蛋白至少有20種，分子質(zhì)量26 k D～56 k D，其中有9種Cx在成年或發(fā)育中的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中有不同程度的表達（Cx26，Cx32，Cx33，Cx36，Cx37，Cx40，Cx43，Cx45，Cx46），成年哺乳類動物腦組織中表達最強的是Cx43，Cx43是Cx基因家族中數(shù)量最為豐富的成員，主要在星形膠質(zhì)細胞中表達［6］。

許多研究表明，Cx43在癲癇的發(fā)生發(fā)展過程中有密切關系［7］。有研究發(fā)現(xiàn)，Cx43隨癲癇的病情發(fā)展而表達上調(diào)，Cx43的表達強度受癲癇發(fā)作時間的影響，癲癇發(fā)作的時間越長，Cx43表達就越多，因此，認為Cx43很可能與癲癇發(fā)作后腦組織結(jié)構(gòu)的重塑有密切關系［8］。有學者利用用免疫組化方法和Western blot方法測定海人藻酸致癇后大鼠不同腦區(qū)、不同時間的Cx43的分布及表達情況，結(jié)果顯示海人藻酸致癇后大鼠的大腦皮層及海馬均有Cx43陽性表達，其表達與致癇時間呈正相關，發(fā)作時間越長，表達越明顯［9］。其有關機制可能是Cx43的表達增高促進了縫隙連接的形成，增加了新的電突觸數(shù)目和電傳導性，導致神經(jīng)元同步化放電的擴大而引起癲癇。

另外，有研究認為廣泛的縫隙連接使星形膠質(zhì)細胞成為一個功能合胞體，當癲癇發(fā)作時，由于大量的Ca2＋進入了神經(jīng)元內(nèi)導致細胞外Ca2＋降低，細胞外Ca2＋減少對癇樣放電的同步化擴散及發(fā)作起重要作用，星形膠質(zhì)細胞興奮引發(fā)的Ca2＋內(nèi)流會在這個功能合胞體中播散開來，稱為Ca2＋波，對神經(jīng)調(diào)節(jié)具有重要意義。Cx43基因敲除后，可以導致星形膠質(zhì)細胞間的縫隙連接傳導及Ca2＋流減弱，但Cx30，Cx40等其他Cx表達未受影響，這說明Cx43在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的生理活動中有著相對其他Cx更重要的作用［10］。

有研究對于手術切除難治性癲癇患者致癇灶分析發(fā)現(xiàn)Cx43 mRNA明顯升高，這可能由于癲癇發(fā)生部位的神經(jīng)元過度同步化放電，使細胞外釋放的K＋增加，為了清除過多的K＋，星形膠質(zhì)細胞使Cx43 mRNA表達代償性增加，縫隙連接數(shù)目增加，使清除K＋的能力增加，有利于維持神經(jīng)元的正常環(huán)境穩(wěn)態(tài)［6］。有研究采用難治性顳葉癲癇患者的海馬組織及正常人的海馬組織進行對照研究，應用免疫熒光標記星形膠質(zhì)細胞激光共聚焦顯微鏡測量Cx43表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，顳葉癲癇患者的海馬組織中星形膠質(zhì)細胞中Cx43表達增多，Cx43含量相對于對照組明顯增加，說明這種Cx43的顯著表達可能加重顳葉癲癇患者的發(fā)作程度［11］。

對于顳葉癲癇的治療策略仍就認為手術是最佳的治療手段，完整的切除前顳葉和海馬等內(nèi)側(cè)結(jié)構(gòu)，是獲得療效最佳的策略［12］。本研究也驗證了這種觀點，所有的患者均進行標準前顳葉切除術，切除范圍包括前顳葉及海馬結(jié)構(gòu)，取得了良好的手術效果，效果優(yōu)良（EngelⅠ＋ Ⅱ級）達到86.7%。對于顳葉癲癇的手術效果，可能與多種因素有關，但均不十分確定，唯一公認的影響手術預后的因素為不完全切除［13］，目前還沒有分子生物學指標能夠?qū)︼D葉癲癇的手術預后有所提示。

本研究發(fā)現(xiàn)，對于手術效果不佳組顳葉癲癇患者Cx43表達較手術效果良好組明顯增高，提示此類癲癇患者已經(jīng)建立了廣泛的細胞間的縫隙連接，構(gòu)成了放電泛化的基礎，部分性的顳葉切除后其他部分可能仍存在癲癇放電，由此分析Cx43對于顳葉癲癇手術的預后可能具有一定的參考價值，縫隙連接蛋白阻斷劑可能是未來抗癲癇藥物的發(fā)展方向。

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