段曉玲 王海英 楊國亭 馮晨 崔瑩

摘要 [目的]探究白樺（Betula platyphylla）葉精油的抑菌和抗氧化活性成分，為白樺木醋液、精油等高附加值植物天然產(chǎn)品的加工利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。[方法]以白樺葉為原料，采用多相同時蒸餾萃取（SDE）法提取白樺葉精油，研究其抑菌、抗氧化活性，通過氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）法分析其揮發(fā)性化學(xué)成分。[結(jié)果]白樺葉精油對金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和大腸桿菌（Escherichia coli）均具有抑制作用，抑菌圈直徑分別為11.90±2.17和（9.01±1.31）mm;白樺葉精油對羥自由基具有較好的清除作用，其EC50為2.294 mg/ml;白樺葉精油主要由烷烴類、酯類、酮類、酚類、醇類、醛類等化合物組成，GC含量最高的化合物是十一烷（58.02%）。[結(jié)論]白樺葉精油在抑菌和抗氧化等深加工產(chǎn)品領(lǐng)域具有潛在開發(fā)價值。

關(guān)鍵詞 白樺;精油成分;抑菌活性;抗氧化活性

中圖分類號 S713 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）33-11746-03

Composition Analysis of Antibacterial and Antioxidant Activities of Essential Oil in Leaves of Betula platyphylla

DUAN Xiao-ling1， WANG Hai-ying1*， YANG Guo-ting2 et al

（1. College of Forestry， Northeast Forestry University， Harbin， Heilongjiang 150040; 2. Center for Ecological Research， Northeast Forestry University， Harbin， Heilongjiang 150040）

Abstract [Objective] Antibacterial and antioxidant activities composition of essential oil in leaves of Betula platyphylla were studied to provide basic data for processing and utilization of wood vinegar，essential oil and other natural plant products of B. platyphylla with high added value. [Method] Essential oil in leaves of B. platyphylla was extracted by multiphase simultaneous distillation extraction（SDE） method with leaves of B. platyphylla as raw materials. Antibacterial and antioxidant activities of essential oil in leaves of B. platyphylla were studied， and their volatile chemical composition were analyzed by gas chromatography-mass spectrometry（GC-MS） method. [Result] The research results show that Staphylococcus aureus and Escherichia coli are inhibited by essential oil in leaves of B. platyphylla， diameter of inhibition zone is （11.90±2.17） mm and （9.01±1.31） mm respectively; Essential oil in leaves of B. platyphylla has good scavenging activity on hydroxy radical， its EC50（concentration for 50% of maximal effect， EC50） is 2.294 mg/ml; Essential oil in leaves of B. platyphylla is mainly composed of alkanes， esters， ketones， phenols， alcohols， aldehydes， and other compounds. The highest GC content compound is undecane（58.02%）. [Conclusion] Essential oil in leaves of B. platyphylla has potential value in the antibacterial and antioxidant products deep processing field.

Key words Betula platyphylla; Essential oil composition; Antibacterial activity; Antioxidant activity

基金項目 黑龍江省自然科學(xué)基金資助項目（C201411）;黑龍江省科技攻關(guān)計劃項目（GC07C330）;中央財政林業(yè)科技推廣示范項目（2009-01）。

作者簡介 段曉玲（1990- ），女，云南騰沖人，碩士研究生，研究方向：林下經(jīng)濟(jì)植物次生代謝產(chǎn)物調(diào)控與應(yīng)用。*通訊作者，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，從事植物資源化學(xué)以及木醋液、精油、纖維素等林下經(jīng)濟(jì)資源利用研究。

收稿日期 2014-10-16

通過森林植物資源化學(xué)加工利用可獲得木醋液、精油等植物天然產(chǎn)品[1-6]。干餾法是獲得木醋液的主要提取方法，原料主要是木材加工廢棄物（木屑等）、枝椏等采伐剩余物。水蒸氣蒸餾法是提取精油的主要方法，原料主要是芳香植物的根、莖、葉、花、果實、種子、木材加工廢棄物（木屑等）、枝椏等采伐剩余物;對于一些較難提取的精油，如杉根精油等，可通過干餾法獲得木醋液和精油的混合物，經(jīng)分離后得到杉根精油[5-7]。精油是植物的次生代謝產(chǎn)物，生物化學(xué)的研究結(jié)果表明，植物遺傳物質(zhì)DNA中的堿基對的排列順序不僅決定植物的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和遺傳，而且決定植物代謝產(chǎn)物的積累。植物主要通過醋酸-丙二酸途徑產(chǎn)生酚類等化合物，甲羥二戊酸途徑產(chǎn)生萜類等化合物[4，6]。樺木科樺木屬芳香植物白樺樹葉可提取精油[8]。木醋液和精油都是植物資源產(chǎn)品，均具有抑菌、抗氧化等生物活性，常應(yīng)用于藥品、食品、化妝品等領(lǐng)域。筆者以白樺樹葉為原料，采用多相同時蒸餾萃取法提取白樺葉精油，研究了其抑菌、抗氧化活性，并通過氣相色譜-質(zhì)譜法測定了白樺葉精油的揮發(fā)性化學(xué)成分，以期為同一種芳香植物的綜合加工利用以及木醋液、精油等高附加值植物天然產(chǎn)品的加工利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料。

白樺鮮葉于2014年6月采自東北林業(yè)大學(xué)校園，采集樹種經(jīng)鑒定為白樺。

1.1.2 試劑。酵母膏、蛋白胨、瓊脂均購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;石油醚、氫氧化鈉、氯化鈉、無水乙醇、硫酸亞鐵、過氧化氫、水楊酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵為分析純，均購自天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠;甲醇為色譜純，購自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 供試細(xì)菌。金黃色葡萄球菌、大腸桿菌均由東北林業(yè)大學(xué)實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 白樺葉精油的提取。

采用多相同時蒸餾萃取法。稱取100 g白樺鮮葉，加入1 L蒸餾水于左側(cè)的物料瓶中，在多相同時蒸餾萃取裝置另一側(cè)的圓底燒瓶中加入100 ml石油醚。同時蒸餾萃取4 h，旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)除去石油醚。稱量所得精油質(zhì)量，計算得率。

1.2.2 白樺葉精油的抑菌活性試驗。

采用濾紙片法和平板菌落計數(shù)法[9]。最低抑菌濃度測定采用二倍稀釋法，根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，以丙酮為溶劑將白樺葉精油配制成0.200 00、0.100 00、0.050 00、0.025 00、0.012 50、0.006 25 g/ml 6個濃度的精油溶液。用直徑6 mm的已滅菌的濾紙片蘸取不同濃度的精油溶液貼于帶菌平板上，操作同抑菌活性試驗。3次重復(fù)，放入人工氣候箱37 ℃下培養(yǎng)24 h，以最小抑菌圈直徑對應(yīng)的待測液濃度作為該菌種的最低抑菌濃度。

1.2.3 白樺葉精油的抗氧化活性試驗。

1.2.3.1 總還原能力測定。

根據(jù)文獻(xiàn)[10]，取1.0 ml不同濃度的精油樣液及抗壞血酸于試管中，依次加入2.5 ml 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS，pH6.6）和2.5 ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的鐵氰化鉀溶液，混勻后于50 ℃水浴中保溫20 min，快速冷卻，再加入2.5 ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的三氯乙酸，離心10 min，取上清液2.5 ml，依次加入2.5 ml蒸餾水、0.5 ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的三氯化鐵，充分混勻，在700 nm波長下測定吸光度（以蒸餾水作調(diào)零空白）。每個點平行操作3次，取平均值。

1.2.3.2 DPPH自由基清除率測定。

測定方法參照文獻(xiàn)[11-12]，分別移取1.0 ml不同濃度的供試樣液及抗壞血酸于試管中，加入3.0 ml 0.000 1 mol/L DPPH自由基溶液，立即混勻，室溫放置15 min，測定517 nm波長下的吸光度（Ai），同時測定1.0 ml樣液加入3.0 ml無水乙醇的吸光度（Aj）及1.0 ml無水乙醇加入3.0 ml DPPH自由基溶液的吸光度（A0）。以1.0 ml蒸餾水和3.0 ml無水乙醇混合液作空白。每個點平行操作3次，取平均值。根據(jù)下式計算試樣對DPPH自由基清除率：

DPPH自由基清除率=[1-（Ai-Aj）/A0]×100%

1.2.3.3 羥自由基清除率測定。

向試管中依次加入1 mmol/L FeSO4溶液1.0 ml、不同濃度樣液1.0 ml、1 mmol/L H2O2 1.0 ml、3 mmol/L水楊酸溶液2.0 ml，混勻，室溫下放置30 min，于510 nm波長處測定吸光度（Ai），用蒸餾水代替水楊酸測定吸光度（Aj），用蒸餾水代替樣液測定吸光度（A0）。每個點平行操作3次，取平均值。根據(jù)下式計算試樣對羥自由基清除率：

羥自由基清除率=[1-（Ai-Aj）/A0]×100%

1.2.4 白樺葉精油的GC-MS分析測定。

用甲醇將木醋液配制成濃度為10 μg/ml的甲醇溶液，利用7890A-7000B型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Agilent公司）分別對試樣進(jìn)行GC-MS分析。色譜分析條件：色譜柱為HP-5MS毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）;檢測器為FID檢測器;初始溫度40 ℃并保持2 min，以10 ℃/min 的升溫速度升到280 ℃并保持2 min;進(jìn)樣口溫度250 ℃，進(jìn)樣量1.0 μl，不分流，氦氣載氣，流速1 ml/min。質(zhì)譜分析條件：EI電離源，接口溫度280 ℃，離子源溫度230 ℃，電子能量70 eV，掃描范圍30～500 u。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理。

采用Excel 2007、SPSS 19.0等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析、處理及圖表的繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 白樺葉精油的抑菌活性 由表1可知，白樺葉精油對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均有抑制作用，抑菌圈直徑分別為11.90±2.17和（9.01±1.31）mm，對金黃色葡萄球菌（G+）的抑制效果優(yōu)于大腸桿菌（G-）。白樺葉精油對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的最低抑菌濃度分別為0.050和0.025 g/ml。

表1 白樺葉精油的抑菌活性

2.2 白樺葉精油的抗氧化活性

2.2.1 總還原力。具有還原能力的物質(zhì)可通過提供氫質(zhì)子將體系中鐵離子還原，從而抑制自由基的產(chǎn)生，一些植物提取物的抗氧化能力與還原能力之間具有很好的相關(guān)性，因此可用還原能力評價抗氧化活性[13]。由圖1可知，白樺葉精油、抗壞血酸隨著濃度的升高總還原能力逐漸增強(qiáng)，且二者與總還原力之間存在顯著的量效關(guān)系，在實測白樺葉精油濃度（10.00～100.00 mg/ml）、抗壞血酸濃度（0.01～0.10 mg/ml）時量效關(guān)系擬合線性方程分別為y=0.008 2x-0.062 9（R2=0.938 3）、y=11.56x-0.158 0（R2=0.947 6）。白樺葉精油EC50值為68.646 mg/ml，抗壞血酸EC50值為0.057 mg/ml。

圖1 白樺葉精油和抗壞血酸的總還原力

2.2.2 DPPH自由基清除率。DPPH自由基的乙醇溶液呈

深紫色，加入自由基清除劑時，由于與其單電子配對而使其吸收逐漸消失，其褪色程度與其接受的電子數(shù)成定量關(guān)系，故用比色法進(jìn)行定量分析，評價樣品的抗氧化活性[14]。從圖2可知，抗壞血酸EC50值為0.020 mg/ml，參照文獻(xiàn)[15]，天然產(chǎn)物白樺葉精油含有多種揮發(fā)性化學(xué)成分，白樺葉精油的DPPH自由基清除活性有待進(jìn)一步研究。

2.2.3 羥自由基清除率。在生命活動的氧化代謝過程中不

圖2 白樺葉精油和抗壞血酸的DPPH自由基清除活性

斷產(chǎn)生各種自由基，其中羥自由基是體內(nèi)最活潑的活性氧，可介導(dǎo)如引起脂質(zhì)過氧化、造成細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞等病理變化，甚至引起細(xì)胞損傷或死亡[16]。因此，羥自由基清除率是反映測試樣抗氧化作用的重要指標(biāo)。從圖3可知，白樺葉精油對羥自由基具有較好的清除作用，清除作用隨樣液濃度的增加而增強(qiáng)，表現(xiàn)出良好的量效關(guān)系。當(dāng)精油濃度為4.00 mg/ml時清除率達(dá)到85.06%，其EC50值為2.294 mg/ml;抗壞血酸EC50值為0.100 mg/ml。

圖3 白樺葉精油和抗壞血酸的羥自由基清除活性

2.3 白樺葉精油的揮發(fā)性化學(xué)成分分析

通過同時蒸餾萃取法提取的白樺葉精油得率為（0.48±0.07）%。所得精油按“1.2.4”條件進(jìn)行GC-MS分析，共鑒定出18種化合物，通過面積歸一化法計算出各組分的GC含量。從表2可知，白

樺葉精油主要由烷烴類、酯類、酮類、酚類、醇類、醛類等化合物組成，GC含量最高的化合物是十一烷（58.02%），GC含量

表2 白樺葉精油的揮發(fā)性化學(xué)成分

較高的化合物為硬脂酸甲酯（6.97%）、棕櫚酸甲酯（5.14%）、萘（2.64%）、2，4-二叔丁基苯酚（2.17%）、丙酸葉醇酯（0.85%）、1，2，4，5-四甲基苯（0.60%）等。十一烷存在于烤煙煙葉、煙氣中;硬脂酸甲酯存在于煙葉中;萘用于防蟲劑等;2，4-二叔丁基苯酚用于殺蟲劑、抗氧劑等;丙酸葉醇酯具有青香、果香和甜香香氣;1，2，4，5-四甲基苯具有類似樟腦的氣味等[17]。

3 結(jié)論

采用多相同時蒸餾萃取法提取的白樺葉精油對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均具有抑制作用，抑菌圈直徑分別為11.90±2.17和（9.01±1.31）mm;白樺葉精油對羥自由基具有較好的清除作用，其EC50值為2.294 mg/ml。

白樺葉精油主要由烷烴類、酯類、酮類、酚類、醇類、

醛類等化合物組成，GC含量最高的化合物是十一烷（58.02%），GC含量較高的化合物為硬脂酸甲酯（6.97%）、棕櫚酸甲酯（5.14%）、萘（2.64%）、2，4-二叔丁基苯酚（2.17%）、丙酸葉醇酯（0.85%）、1，2，4，5-四甲基苯（0.60%）等。白樺葉精油在抑菌和抗氧化等深加工產(chǎn)品領(lǐng)域具有潛在的開發(fā)價值。

參考文獻(xiàn)

[1] 沈兆邦.我國森林資源化學(xué)利用的發(fā)展前景[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，1999，19（4）：75-80.

[2] 邵海，龔鋼明.植物精油在藥理和農(nóng)藥方面的研究進(jìn)展[J].中國野生植物資源，2008，27（5）：5-9.

[3] 劉志明，王海英，劉姍姍.小蓬草精油的分離組分比較分析[J].中國野生植物資源，2012，31（5）：29-32.

[4] 楊利民.植物資源學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2008：1-444.

[5] 劉志明，王海英，王芳，等.側(cè)柏?fù)]發(fā)性次生代謝產(chǎn)物的提取及GC-MS分析[J].中國野生植物資源，2011，30（3）：51-55.

[6] 唐建軍，項田夫，張祿源，等.植物次生代謝、離體培養(yǎng)條件下次生代謝物積累及其調(diào)控研究進(jìn)展[J].中國野生植物資源，1998，17（4）：1-6.

[7] 周文富，黃忠興，徐芃，等.杉根精油分離及其化學(xué)成分測定[J].精細(xì)化工，2007，24（11）：1095-1098.

[8] 王羽梅.中國芳香植物（上冊）[M].北京：科學(xué)出版社，2008：349-350.

[9] 王海英，楊國亭，任廣英，等.精制蒙古櫟和雜木木醋液的抑菌活性成分分析[J].廣東化工，2012，39（11）：14-15，19.

[10] LIYANA-PATHIRANA C M，SHAHIDI F，ALASALVAR C.Antioxidant activity of cherry laurel fruit（Laurocerasus officinalis Roem.）and its concentrated juice[J].Food Chemistry，2006，99（1）：121-128.

[11] 龔鋼明，張赟彬，王化田.紅景天多酚物質(zhì)抗氧化作用研究[J].食品科學(xué)，2008，29（2）：91-93.

[12] 鄧心蕊，王振宇，劉冉，等.紅皮云杉球果乙醇提取物的抗氧化功能研究[J].北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報，2014，36（2）：94-101.

[13] YEN G C，CHEN H Y，PENG H H.Evaluation of the cytotoxicity，mutagenicity and antimutagenicity of emerging edible plants[J].Food and Chemical Toxicology，2001，39（11）：1045-1053.

[14] 劉婷，厙文波，王婷，等.水蒸氣蒸餾和超臨界萃取薰衣草精油抗氧化作用研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2009，20（12）：3035-3037.

[15] 林戀竹，趙謀明.反應(yīng)時間對DPPH·法、ABTS+·法評價抗氧化性結(jié)果的影響[J].食品科學(xué)，2010，31（5）：63-67.

[16] 王多寧，張小莉，楊穎，等.百合多糖對羥自由基的清除作用[J].陜西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2006，29（4）：53-55.

[17] 林翔云.香料香精辭典[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2007：1-534.