牛偉博

摘要：DREB（干旱應答元件結(jié)合蛋白）轉(zhuǎn)錄因子是AP2/EREBP的一個亞族。由于其過量表達能夠提高植物抗旱、耐鹽、耐低溫、抗凍甚至抵抗重金屬等逆境脅迫的能力，因此DREB轉(zhuǎn)錄因子基因被作為應用基因工程途徑進行植物抗逆性狀改良的理想候選基因。本文主要綜述了DREB轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)、功能以及近年來國內(nèi)外新的DREB轉(zhuǎn)錄因子基因的發(fā)現(xiàn)及其在培育抗逆性轉(zhuǎn)基因植物中的應用，以期為植物抗逆分子育種改良提供參考。

關(guān)鍵詞：DREB；轉(zhuǎn)錄因子；逆境脅迫；轉(zhuǎn)基因植物

中圖分類號：Q943.2 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2014）08-0017-04

干旱、低溫、高鹽等非生物逆境脅迫是農(nóng)業(yè)、林業(yè)、草業(yè)生產(chǎn)中嚴重的自然災害，世界每年因此造成巨大損失。這些非生物逆境脅迫能夠引起植物一系列的相關(guān)響應，比如響應不同脅迫導致一些轉(zhuǎn)錄因子的表達，進而調(diào)節(jié)相關(guān)下游基因的大量表達，通過操縱轉(zhuǎn)錄因子的表達去提高植物應對逆境脅迫的能力^[1]。因此，為了解決糧食危機，改善生態(tài)環(huán)境，植物基因工程被廣泛應用到農(nóng)作物以及森林樹木，實現(xiàn)了農(nóng)作物和林木的優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)，改良其經(jīng)濟性狀，加速優(yōu)良新品種的培育^[2-3]。

轉(zhuǎn)錄因子（transcription factor，TF），又稱反式作用因子，是一群能與真核基因啟動子區(qū)域中的順式作用元件發(fā)生特異性結(jié)合，從而保證目的基因以特定的強度在特定的時間與空間表達的DNA結(jié)合蛋白質(zhì)。當植物受到逆境脅迫時，細胞膜上具有各種不同信號的受體分子（其中包括感受水分、溫度、鹽度的受體分子），這些受體分子感知逆境信號后，使逆境信號沿著“膜蛋白受體-IP3（1，4，5-肌醇三磷酸）、Ca2+等第二信使分子-蛋白激酶-轉(zhuǎn)錄因子-抗逆基因”途徑在植物細胞內(nèi)逐級傳遞^[4]。與逆境相關(guān)、編碼產(chǎn)物參與信號傳遞途徑和基因表達調(diào)控過程的轉(zhuǎn)錄因子主要包括五個家族：MYB（v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog）、bZIP（basic leucine zipper）、WRKY（因含有高度保守的核心氨基酸序列WRKYGQK而命名）、AP2/EREBP（APETALA2/ethylene-responsive element binding proteins）和NAC（因其N端為保守的大約150個氨基酸NAC結(jié)構(gòu)域命名）^[5]。其中，DREB（dehydration responsive element binding protein，干旱應答元件結(jié)合蛋白）轉(zhuǎn)錄因子是AP2/EREBP的一個亞族，主要功能是調(diào)節(jié)植物對逆境脅迫等的應答反應。

DREB轉(zhuǎn)錄因子作為干旱、低溫、高鹽脅迫應答的主要成分，可與下游基因啟動子中的CRT/DRE（C-repeat/dehydration responsive element）順式作用元件相結(jié)合，調(diào)節(jié)一系列依賴該順式作用元件的抗逆功能基因的表達，進而引起脯氨酸、可溶性糖、葉綠素等含量的提高，從而增強植物對于干旱、低溫以及高鹽等逆境的抗性^[2]。本文主要綜述DREB轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)、功能，以及近幾年來國內(nèi)外對DREB轉(zhuǎn)錄因子的研究進展，并對DREB轉(zhuǎn)錄因子在農(nóng)業(yè)、林業(yè)、草業(yè)培育抗逆轉(zhuǎn)基因植物中的應用進行概括。

1 DREB轉(zhuǎn)錄因子

1.1 DREB轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)

自1997年Stockinger^[6]首次從擬南芥cDNA文庫中分離到編碼DREB蛋白的CBF1基因以來，已經(jīng)從各種草本植物中克隆出大量的DREB類基因，近年來，又在木本植物相繼克隆出DREB類基因。目前從NCBI（National Center for Biotechnology Information）上可以檢索到的DREB基因的mRNA 共有368條。從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析，DREB轉(zhuǎn)錄因子一般由4個獨立功能區(qū)域組成，包括：（1）DNA 結(jié)合域（DNA binding domain）；（2）轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)（transcription regulation domain）；（3）核定位信號區(qū)（nuclear localization signal，NLS）；（4）寡聚化位點（oligomerization domain）。

DREB轉(zhuǎn)錄因子家族中的AP2結(jié)構(gòu)域高度保守，而N端和C端的相似性比較低。AP2結(jié)構(gòu)域由60個氨基酸組成，有VRG和RAYD兩個保守區(qū)。VRG含有20個氨基酸，大多為堿性氨基酸，有助于和DNA的結(jié)合；RAYD由40個氨基酸組成，其可以通過影響VRG 區(qū)的構(gòu)象或通過與其他蛋白的相互作用來調(diào)節(jié)AP2結(jié)構(gòu)域與DNA 的結(jié)合。AP2結(jié)構(gòu)域的第14位為纈氨酸（Valine，V），第19位為谷氨酸（Glutamic，E），這兩個位點非常保守，是與DRE作用元件相互結(jié)合的關(guān)鍵位點^[7]。DREB轉(zhuǎn)錄因子的二級結(jié)構(gòu)具有典型的結(jié)構(gòu)特征：堿性氨基酸富集于N端，是核定為信號區(qū)；而酸性氨基酸富集于C端，為轉(zhuǎn)錄激活區(qū)。

1.2 DREB轉(zhuǎn)錄因子的功能

近年來通過對DREB類轉(zhuǎn)錄因子功能的深入研究，發(fā)現(xiàn)DREB在干旱脅迫等逆境環(huán)境下具有重要作用，同時一個轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)控多個與抗逆性有關(guān)基因的表達，這相對于單純使用下游某種單一功能基因來改變植物的抗逆能力具有顯著的優(yōu)點。從表1可以看出，不同植物克隆到的DREB基因在逆境下的表達特性主要集中在抗旱、耐低溫、抗凍和耐鹽等方面，甚至還具有抗Na2CO3、NaHCO3以及重金屬^[8]（銅、鎘）等能力，表明DREB基因主要參與植物對逆境脅迫的應答。

2 DREB轉(zhuǎn)錄因子在培育抗逆性轉(zhuǎn)基因植物中的應用

與傳統(tǒng)的植物育種方法相比，基因工程技術(shù)具有時間短、效率高、提高植物抗逆性強等優(yōu)點。同時，DREB類轉(zhuǎn)錄因子在植物逆境脅迫中發(fā)揮著重要作用。DREB類轉(zhuǎn)錄因子基因的表達可以同時調(diào)控下游多個相關(guān)抗逆基因的表達，使植物抵抗逆境環(huán)境的綜合能力得到提高。自從擬南芥CBF1基因^[6]發(fā)現(xiàn)之后，大量的DREB基因首先從草本植物中被分離和鑒定，并且在草本植物抗逆性轉(zhuǎn)化中得到了普遍應用。由于木本植物壽命長、體型高大等特點，為了抵御外界不同自然環(huán)境的侵害，形成了比草本植物更為復雜的抗逆分子機制。但隨著近年來分子生物學技術(shù)的進一步發(fā)展，越來越多的DREB類轉(zhuǎn)錄因子基因同樣從木本植物中篩選出來并進一步得到轉(zhuǎn)化植株。

2.1 DREB轉(zhuǎn)錄因子基因在農(nóng)業(yè)中的應用

在農(nóng)作物中發(fā)現(xiàn)的DREB類轉(zhuǎn)錄因子基因很多，謝登雷等^[25]利用電子克隆和 RT-PCR 方法從高粱（Sorghum bicolor）中克隆到SbDREB2基因，通過氨基酸序列分析，該基因編碼的蛋白在 82～145 區(qū)含有DREB類轉(zhuǎn)錄因子家族特有的AP2保守結(jié)構(gòu)域，與玉米DREB2A、水稻 DREB1蛋白相似度分別為 84%和69%。Real-time PCR分析結(jié)果顯示， SbDREB2 基因在高粱根、莖、葉中均能表達，并且在根中的表達量為莖中表達量的2.5倍，屬于組成型表達。受干旱、高鹽以及脫落酸（abscisic acid，ABA）的強烈誘導，但幾乎不受低溫的影響。Lucas等^[26]在野生二粒小麥（Triticum dicoccoides）中克隆得到TdicDRF1基因，Real-time PCR 表達特征性顯示，在干旱脅迫條件下，該基因在小麥根中的表達量顯著增加，然而在葉中的表達量幾乎沒有變化，說明了該基因的組織特異性表達。劉曉穎等^[27]從白菜（Brassica pekinensis）中分離得到BpDREB1基因，進化樹分析結(jié)果表明，BpDREB1屬于DREB 亞家族中A1亞族，該基因受低溫、干旱誘導表達，但幾乎不受高鹽處理的影響，擬南芥經(jīng)低溫誘導后，過量表達BpDREB1 基因，體內(nèi)的可溶性糖和脯氨酸含量顯著升高，以更好地適應脅迫環(huán)境。

DREB基因在農(nóng)業(yè)育種中的應用普遍，利用OsDREB2A基因提高水稻（Oryza sativa）TNG67的抗性，在誘導型啟動子4ABRC的作用下，分別通過干旱脅迫和鹽脅迫，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因水稻的存活率明顯高于非轉(zhuǎn)基因水稻和轉(zhuǎn)空載體的水稻，并且OsDREB2A受ABA的強烈誘導^[19]，說明OsDREB2A基因在逆境條件下保護水稻細胞。周永斌等^[28]研究了不同干旱脅迫下轉(zhuǎn)W16基因（一種DREB類基因）小麥基因表達特性及其抗旱機制，通過RT-PCR結(jié)果顯示，在正常灌溉條件下，W16基因在野生型小麥中有微弱表達，隨著脅迫增強，表達量增加，在干旱脅迫12 h 表達量達到峰值，接著隨著脅迫加劇，表達量下降，呈“上升—峰值—下降”的特點，而轉(zhuǎn)W16基因小麥在Ubiquitin 啟動子作用下，W16基因表達恒定且維持在較高的水平；抗性生理生化分析結(jié)果表明，在不同的干旱脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因植株的葉綠素含量、脯氨酸含量、可溶性糖含量、水分利用效率的變化均高于受體對照，尤其在重度干旱脅迫下更加高于受體對照。DREB類轉(zhuǎn)錄因子基因也在大麥^[12]、番茄^[15]、馬鈴薯^[16]、煙草^[23]等農(nóng)作物育種中得到應用。

2.2 DREB轉(zhuǎn)錄因子基因在林業(yè)中的應用

近年來，DREB類轉(zhuǎn)錄因子基因在林木中被相繼分離和鑒定，成為DREB類轉(zhuǎn)錄因子的一個研究熱點。翟俊峰等^[29]首次從銀中楊（Populus albaxp）中克隆得到PaDREB基因，Real-time PCR檢測結(jié)果顯示，干旱、高鹽、低溫以及ABA均能誘導PaDREB基因的表達。并且經(jīng)過同源性比較和系統(tǒng)發(fā)育分析證實該基因與月季DREB2C基因具有較高的同源性。陳金煥等^[30]從胡楊（Populus euphratica）中分離得到PeDREB3和PeDREB4 2個編碼DREB類蛋白的基因，這2個基因在胡楊的根、莖、葉中均有表達。序列分析結(jié)果顯示，PeDREB3和PeDREB4含有非典型的AP2/ERF結(jié)構(gòu)域，并且利用改進的酵母單雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)其能夠在酵母中激活下游報告基因的表達。Tang等^[20]從麻風樹（Jatropha curcas）分離得到JcDREB基因，通過序列分析和酵母單雜交顯示，JcDREB屬于DREB類轉(zhuǎn)錄因子A6亞族基因。通過Real-time PCR檢測結(jié)果顯示，干旱、高鹽、低溫均能誘導JcDREB基因的表達，而不受ABA的誘導。在擬南芥中過量表達JcDREB基因能夠顯著提高擬南芥的耐鹽和抗凍性。

目前DREB類轉(zhuǎn)錄因子已經(jīng)在林木育種中得到應用。楊春霞等^[31]以美洲黑楊雜種（Populus×Euramericana cv.）優(yōu)良無性系南林895楊為轉(zhuǎn)基因受體材料，利用農(nóng)桿菌GV3101介導法轉(zhuǎn)化DREB1C基因，得到轉(zhuǎn)基因抗性植株。通過抗性試驗，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因植株的抗旱、耐鹽性能均高于非轉(zhuǎn)基因植株。 Li等[2，18]利用FaDREB1、FaDREB2基因提高構(gòu)樹抵抗逆境的能力。在CaMV35S（cauliflower mosaic virus 35S）啟動子的誘導下，和野生型植株相比，轉(zhuǎn)FaDREB1、FaDREB2基因構(gòu)樹具有更強的抵御干旱和鹽害的能力。在干旱脅迫13 d或者250 mmol/L NaCl處理15 d，所有的野生型植株死亡，然而過量表達FaDREB1、FaDREB2基因的轉(zhuǎn)基因植株存活了下來。轉(zhuǎn)基因構(gòu)樹在干旱處理和高鹽處理條件下，其葉片含水量、葉綠素含量、脯氨酸含量以及可溶性糖含量的積累均高于野生構(gòu)樹，說明轉(zhuǎn)基因植株具有更好的抗性。并且在正常的生長條件下，CaMV35S啟動子并沒有引起植株生長的延滯和矮化。目前DREB類轉(zhuǎn)錄因子基因也在蘋果^[22]、胡楊^[24]等林木育種中得到應用。

2.3 DREB轉(zhuǎn)錄因子基因在草業(yè)中的應用

謝健等^[32]從紫花苜蓿（Medicago sativa L.）中分離得到DREB1 轉(zhuǎn)錄因子基因，分別對其編碼蛋白的理化性質(zhì)、二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)進行了分析，結(jié)果顯示，紫花苜蓿共編碼218個氨基酸，該蛋白質(zhì)屬于AP2家族，為親水蛋白且沒有信號肽。Peng等^[21]基于羊草（Leymus chinensis）的高通量測序結(jié)果，克隆得到一個新的基因LcDREB3a，受干旱、高鹽和ABA的誘導。并且通過將LcDREB3a轉(zhuǎn)入擬南芥驗證該基因的功能，結(jié)果顯示，和非轉(zhuǎn)基因擬南芥相比，過量表達LcDREB3a基因并沒有引起植株生長延滯，并且轉(zhuǎn)基因植株具有更強的抵抗干旱和鹽害的能力，該基因能夠提高植物適應逆境的能力。Wang等^[23]采用RACE技術(shù)從檸條（Caragana korshinskii）中分離到CkDREB基因，該基因全長1 743 bp，編碼345個氨基酸，干旱、高鹽、低溫均能誘導該基因的表達，外源性的ABA也能提高CkDREB基因的表達。通過在煙草中過量表達該基因，在正常條件下能夠顯著提高煙草的抗鹽和抵抗?jié)B透脅迫的能力，并且能夠誘導下游目標基因的表達，這些結(jié)果說明CkDREB基因在檸條抗逆中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。

目前，也有關(guān)于DREB轉(zhuǎn)錄因子在牧草育種中應用的報道。 Zhou等^[17]利用農(nóng)桿菌介導得到轉(zhuǎn)PeDREB2a基因百脈根（Lotus corniculatus）植株，干旱和低鹽條件均引起轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株的生長延滯，但是對野生型植株來說這種生長延滯更為明顯，說明過量表達PeDREB2a基因能夠提高百脈根抵抗干旱和低鹽的能力。同時DREB轉(zhuǎn)錄因子基因也在結(jié)縷草^[33]、狼尾草^[34]等牧草中得到應用。

3 展望

DREB類轉(zhuǎn)錄因子在植物逆境信號轉(zhuǎn)導中占據(jù)著重要的位置。國內(nèi)外已對DREB轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)，在逆境脅迫下的信號轉(zhuǎn)導途徑以及培育轉(zhuǎn)基因抗逆植物進行了大量研究。通過揭示DREB轉(zhuǎn)錄因子在植物逆境脅迫應答過程中的作用機制，導入或者改良轉(zhuǎn)錄因子來調(diào)節(jié)下游多個抗逆功能基因綜合發(fā)揮作用，進而達到提高植物抵抗逆境的能力。但目前仍然存在著許多問題有待進一步研究，如植物的抗逆性是許多基因相互疊加的綜合效果，形成了極為復雜的基因表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，這些調(diào)控網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)有待進一步深入研究。DREB轉(zhuǎn)錄因子基因作為提高植物響應干旱、高鹽、低溫的重要候選基因，近期又有報道一些DREB基因能夠增強植物的耐熱性^[35-36]和抵御重金屬的能力，因此分離和鑒定更多的、新的DREB基因是非常有用的，這對于深入研究植物的抗逆機制以及進行抗逆農(nóng)作物、林木、牧草新品種的培育具有重要意義。

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