王 英，尹顯慧，2*，王 梅，龍友華，2

(1.貴州大學作物保護研究所，貴州 貴陽550025;2.貴州大學 貴州山地農(nóng)業(yè)病蟲害重點實驗室，貴州 貴陽550025)

番茄青枯病由青枯雷爾氏菌(Ralstonia solanacearum，簡稱青枯菌)引起的植物細菌性維管束病害，在高溫、高濕環(huán)境下容易暴發(fā)，廣泛分布于熱帶、亞熱帶和溫帶地區(qū)，甚至在部分低溫地區(qū)同樣發(fā)現(xiàn)青枯菌的存在，給全球農(nóng)作物生產(chǎn)帶來了極大的威脅［1－3］。一般連種3～5年，番茄的產(chǎn)量和品質就會受到嚴重影響。發(fā)病初期，植株上部葉片的葉柄出現(xiàn)下垂，而后葉片漸次枯萎，同時莖部出現(xiàn)不定根，植株快速萎蔫并逐漸枯死［4］，輕則減產(chǎn)20%～40%，嚴重時達60%以上甚至絕收［5］。在我國長江流域及其以南地區(qū)發(fā)生較為普遍，如江蘇、廣東、湖北、浙江、福建、四川、貴州等各地均有發(fā)生，給我國番茄生產(chǎn)造成了嚴重損失［6］。目前，該病的有效防治仍然是世界難題。因此，本文通過10種殺菌劑對修文地區(qū)采集的青枯病病菌進行室內(nèi)毒力測定，以期了解番茄青枯病防治中已登記的殺菌劑對青枯雷爾氏菌的抑菌效果和病原菌對這些殺菌劑的抗性水平;并通過已登記殺菌劑與未登記對青枯雷爾氏菌的抑菌效果對比，篩選出新的可替代化學、生物殺菌劑，為防治番茄青枯病提供更多有效、安全的用藥參考。

1 材料與方法

1.1 病原菌分離純化

在貴州省貴陽市修文縣番茄青枯病重發(fā)田采集番茄青枯病病株的地上莖稈部位，用75%的酒精擦拭病株基部的莖桿兩端，迅速過火焰燒盡酒精，用消過毒的解剖刀削平莖稈兩端，將其插入盛有滅菌水的三角瓶中，然后罩上無菌燒杯，放置于室溫條件下。待有菌膿從端部溢出后，用接菌環(huán)蘸取少量菌膿在TTC培養(yǎng)基上劃線，25℃培養(yǎng)48 h。待有單菌落長出時，用接菌環(huán)挑取單菌落接種到NA培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)48 h后保存于4℃冰箱中備用。

1.2 培養(yǎng)基

NA培養(yǎng)基:牛肉浸膏3 g，蛋白胨5 g，瓊脂14 g，蔗糖20 g，雙蒸蒸餾水1 000 mL，pH值7.0。

TTC培養(yǎng)基:牛肉浸膏3 g，蛋白胨10 g，瓊脂15 g，氯化鈉5 g，TTC 0.01 g，雙蒸蒸餾水1 000 mL，pH值7.5。

1.3 供試藥劑

本試驗供試藥劑見表1。

表1 供試藥劑Tab.1 The tested fungicides

1.4 試驗方法

1.4.1 供試藥劑對番茄青枯病菌EC50的測定與比較 采用改進的圓形濾紙片法［7－8］，用微量加樣器吸取108cfu/mL的細菌懸液1 mL至9 cm直徑的培養(yǎng)皿上，倒人冷卻溶化的9 mLNA瓊脂的固體培養(yǎng)基混勻凝固。用打孔器將濾紙打成5 mm直徑圓片，分別浸入表2所列藥劑濃度的藥液里，移到平板上，等距放置，每處理3皿，每皿3片，設無菌水為對照。將培養(yǎng)皿置于28℃恒溫培養(yǎng)箱里培養(yǎng)36 h后，用十字交叉法測量抑菌圈直徑，然后采用農(nóng)藥室內(nèi)生物測定數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)軟件［9］計算出各種殺菌劑對番茄青枯病病菌的抑制中濃度EC50及其95%置信區(qū)間、相關系數(shù)R。通過EC50值比較供試殺菌劑對番茄青枯病菌的抑菌效果。

表2 各供試藥劑配制的濃度梯度Tab.2 The concentration gradients of tested fungicides

1.4.2 番茄青枯病菌對供試殺菌劑抗性水平測定

病原菌對供試殺菌劑(活體生物殺菌劑除外)的抗性劃分，參考趙曉軍等［10］的方法并做一定的調(diào)整:采用Yarden標準，以藥劑0.5 mg/L作為鑒別濃度，進行最低抑制濃度(MIC)測定，把菌落不能在鑒別濃度上正常生長的定為敏感藥劑，菌落能在鑒別濃度上正常生長的定為抗性藥劑，根據(jù)各藥劑的EC50，計算抗性水平。根據(jù)抗性水平，將不同的番茄青枯病菌分為4個抗性類型(表3)。

抗性水平=抗性藥劑EC50/鑒別濃度

2 結果與分析

2.1 番茄青枯病的癥狀

番茄青枯病一般在成株期發(fā)病。開始顯示癥狀時，頂端葉片萎蔫下垂(圖1)，后下部葉片萎蔫，最后中部葉片萎蔫，有時一側葉片先萎蔫或整株葉片同時萎蔫。發(fā)病初期，葉色變淺，病株白天萎蔫，傍晚復原。當濕度大時，病莖上出現(xiàn)水浸狀斑塊，后斑塊變?yōu)楹稚?，剖開后可以看到病莖維管束為褐色(圖2)，橫切該病莖，用手擠壓，有白色菌液從維管束中溢出。

表3 抗性類型Tab.3 The type of resistance level

圖1 番茄青枯病發(fā)病初期Fig.1 Initial stage of tomato bacterial wilt

圖2 番茄青枯病的病莖Fig.2 Diseased stem infected by tomato bacterial wilt

2.2 番茄青枯病病原物

鏡檢可見菌體為短桿狀單細胞，單生或雙生，兩端圓，極生1～2根鞭毛。在瓊脂培養(yǎng)基上菌落為圓形或不規(guī)則，外緣為白色，中央為淡粉紅色，革蘭氏染色為陰性。

2.3 殺菌劑對青枯病菌的EC50比較

2.3.1 已登記殺菌劑之間的比較 已登記的3種殺菌劑中，有1種化學藥劑和2種生物制劑，EC50值見表4，其中以3%中生菌素WP的EC50值最小，也是10供試藥劑中對番茄青枯病菌抑菌效果最好的;其次是20%噻森銅SC;0.1億cfu/克多粘類芽孢桿菌FG是活體細菌類微生物殺菌劑，其EC50值為0.071×108cfu/L。

2.3.2 未登記殺菌劑之間的比較 從表4可以看出，在未登記7種殺菌劑中，有2種生物制劑和5種化學藥劑。2種生物制劑的抑菌活性均比化學藥劑要強，其中氨基寡糖素是D－氨基葡萄糖以聚糖，可誘導植物的抗病性［11］，其對番茄青枯病的抑菌活性優(yōu)于生產(chǎn)上常用的72%農(nóng)用硫酸鏈霉素WP，其EC50值為2.180 mg/L。5種化學殺菌劑的EC50值中，53%喹啉銅WP的最小，其次為20%葉枯唑WP、1.5%噻霉唑EW和57.6%氫氧化銅GF抑菌效果最差的為80%代森錳鋅WP。

表4 不同殺菌劑對番茄青枯病菌的毒力測定結果Tab.4 Regression equation and EC50 of fungicides against Ralstonia solanacearum

2.3.3 未登記殺菌劑與已登記殺菌劑EC50值的比較 從表4可以看出，在所有供試殺菌劑(除0.1億cfu/克多粘類芽孢桿菌FG以外)中，已登記殺菌劑的EC50值普遍比未登記殺菌劑的EC50值低，而且生物殺菌劑的抑菌效果均好于化學藥劑。但未登記殺菌劑中，0.5%氨基寡糖素AS的EC50值稍高于3%中生菌素WP的EC50值，低于20%噻森銅SC的EC50值，對番茄青枯病菌的抑制作用顯著;在未登記殺菌劑中，72%農(nóng)用硫酸鏈霉素WP的抑菌效果良好，優(yōu)于已登記殺菌劑20%噻森銅SC。

2.4 青枯病菌對供試殺菌劑抗性水平的比較

病原菌對3種已登記殺菌劑和7種未登記殺菌劑的抗性水平見表5。病原菌對已登記藥劑中3%中生菌素WP和未登記藥劑中0.5%氨基寡糖素AS表現(xiàn)為敏感外，對其余7種殺菌劑均表現(xiàn)出一定的抗藥性，特別是對80%代森錳鋅WP表現(xiàn)出特高抗水平，對57.6%氫氧化銅GF和53%喹啉銅WP達到高抗水平，而對20%葉枯唑WP表現(xiàn)出中抗水平，對72%農(nóng)用硫酸鏈霉素WP產(chǎn)生了一定的抗藥性。

表5 各種殺菌劑對番茄青枯病菌的抗性水平Tab.5 The resistance levels of the tested fungicides on Ralstonia solanacearum

3 結論與討論

殺菌劑對病原菌的EC50值常常是衡量殺菌劑對病原菌抑制作用的重要指標，可為藥劑進行田間或保護地的實際藥效試驗提供參考［12］，EC50值越小，則說明供試藥劑對番茄青枯病菌的抑制效果越好，在實際應用中對青枯病的防治效果可能就越好。

在已登記殺菌劑中，中生菌素的抑制作用最好。中生菌素是一種農(nóng)用抗生素，對水稻白葉枯病、白菜軟腐病、柑橘潰瘍病等農(nóng)作物細菌性病害具有良好的防治效果，通過抑制病原細菌蛋白質的肽鍵生成，最終導致細菌死亡，同時可刺激植物體內(nèi)植保素及木質素的前體物質的生成，從而提高植物的抗病能力［13］，使用安全，已登記在番茄青枯病防治中使用。本試驗中該藥劑對番茄青枯病菌的抑菌效果最好，且供試病原菌對其表現(xiàn)敏感，表明中生菌素為番茄青枯病防治中的優(yōu)先之選;另外多粘類芽孢桿菌為修文地區(qū)細菌性活體生物制劑，其代謝產(chǎn)物中含有多種可利用的生物活性物質，可以通過與病原菌在生態(tài)位競爭生存空間和營養(yǎng)物質、對病害因素的解毒以及產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物達到抑制、殺死或者溶解病原的作用，已報道對細菌性土傳病害——植物青枯病具有很好的防治效果［14］;而病原菌對噻森銅已表現(xiàn)出中抗水平，應引起重視，在生產(chǎn)中要注意交替用藥。

在未登記殺菌劑中，抑菌作用最強的是氨基寡糖素。氨基寡糖素由幾丁質降解得殼聚糖后再降解制得，或由微生物發(fā)酵提取的低毒殺菌劑，通過對植物細胞的作用，誘導植物體產(chǎn)生酚類化合物、木質素、植保素、病程相關蛋白等抗病物質，并提高與抗病代謝相關的防御酶和活性氧清除酶系統(tǒng)的活性，還可以溶解真菌、細菌等病原體細胞壁，干擾病毒RNA的合成，達到防止病害的目的，能活化植物細胞，調(diào)節(jié)和促進植物生長，提高抗逆力［15］。它在環(huán)境中易于降解，完全不會對環(huán)境造成污染，兼有藥效和肥效雙重生物調(diào)節(jié)功能的特點，國內(nèi)目前氨基寡糖素農(nóng)藥，經(jīng)廣泛的田間實驗及室內(nèi)驗證對西瓜枯萎病、棉花黃萎病、番茄晚疫病、煙草病毒病、黃瓜白粉病、生菜立枯病、辣椒疫病等均有很好的防效［16］?？椎掠⒑托こ鐒傄褕蟮懒税被烟撬貙Ψ亚嗫莶【哂辛己玫姆乐巫饔茫?7］，但還沒有登記作為番茄青枯病的防治藥劑。本試驗中番茄青枯病菌對氨基寡糖素同樣表現(xiàn)敏感，該殺菌劑的抑菌效果接近中生菌素，可開展更深入的研究;其次農(nóng)用硫酸鏈霉素對番茄青枯病的抑菌效果也相對較好，而且農(nóng)用硫酸鏈霉素為農(nóng)用抗生素，其作用機制與常用化學殺菌劑不同，因此可作為青枯病防治時交替用藥的選擇。

近年來，生防制劑作為IPM(Integrated Pest Management)的重要組成部分，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮著越來越重要的作用。中生菌素、氨基寡糖素、多粘類芽孢桿菌和農(nóng)用硫酸鏈霉素均屬于生物殺菌劑，具有人畜安全，對自然環(huán)境安全、無污染，病原菌不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點，在本試驗中，4種生物殺菌劑均對番茄青枯病菌表現(xiàn)出良好的抑菌效果，因此今后在修文地區(qū)防治番茄青枯病時，建議選用4種藥劑交替施用，以保證番茄的綠色安全生產(chǎn)。

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