陳萬(wàn)勤等

摘要：建立了磺胺藥物殘留的高效液相色譜光化學(xué)在線(xiàn)衍生熒光檢測(cè)方法，并應(yīng)用于豬肉的檢測(cè)。樣品經(jīng)過(guò)乙腈提取，色譜柱分離后，通過(guò)在線(xiàn)光化學(xué)衍生后，用熒光檢測(cè)器進(jìn)行直接檢測(cè)。優(yōu)化后的色譜條件：Eclipse Plus C18柱（250 mm × 4.6 mm， 5.0 μm），流動(dòng)相為均含0.2%甲酸的乙腈、甲醇和水梯度洗脫，檢測(cè)激發(fā)波長(zhǎng)為248 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為350 和412 nm。各種磺胺在各自濃度范圍內(nèi)線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)R2>0.999，回收率在85.7%～101.1%之間，RSD為1.9%～6.6%（n=6），各磺胺的檢出限（S/N=3）為0.2～3.0 μg/kg，定量限（S/N=10）為0.5～10.0 μg/kg。

關(guān)鍵詞：光化學(xué)在線(xiàn)衍生；高效液相色譜熒光檢測(cè)法；磺胺

1引言

磺胺（Sulfonamides， SAs）是一類(lèi)廣譜抗菌藥物，廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)和畜牧業(yè)，是預(yù)防和治療細(xì)菌感染性疾病的化學(xué)藥物?；前奉?lèi)藥物還用于馬、牛的傳染性腦膜炎，羊下痢、豬下痢和弓形體病，并且對(duì)于禽類(lèi)球蟲(chóng)病具有較好療效[1]。由于養(yǎng)殖業(yè)中磺胺類(lèi)藥物的使用導(dǎo)致了動(dòng)物源性食物中殘留，從而危害人體健康[2，3]。我國(guó)和歐盟均規(guī)定了磺胺在動(dòng)物組織中的最高殘留限量[4，5]。動(dòng)物組織中磺胺的檢測(cè)方法主要有液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[6～8]，液相色譜紫外檢測(cè)法[9～11]，液相色譜熒光檢測(cè)法[12，13]?；前奉?lèi)藥物自身不具有熒光活性，采用熒光檢測(cè)法時(shí)通常需要進(jìn)行柱前或柱后化學(xué)試劑衍生才能進(jìn)行檢測(cè)。研究發(fā)現(xiàn)，磺酰胺基是光化學(xué)活性基團(tuán)，在紫外光照射下會(huì)發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)物具有熒光性質(zhì)，通過(guò)熒光光度法可以對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)[14～17]。最近研制出一種光化學(xué)在線(xiàn)衍生器，應(yīng)用于高效液相色譜后，可以進(jìn)行在線(xiàn)光化學(xué)衍生使分子產(chǎn)生熒光活性，利用熒光檢測(cè)器可以有效地檢測(cè)[18，19]。相比于柱前或柱后化學(xué)試劑衍生法，光化學(xué)衍生不需要額外的衍生化試劑，也不需要柱后衍生反應(yīng)的試劑泵，減少了人工操作，同時(shí)也避免衍生化過(guò)程中人為操作因素帶來(lái)的誤差。光化學(xué)衍生不引入其他雜質(zhì)，減少了人體與有毒試劑的接觸和曝露，更加綠色、環(huán)保、簡(jiǎn)便、快捷。到目前為止，關(guān)于光化學(xué)柱后衍生高效液相色譜熒光法在磺胺類(lèi)藥物檢測(cè)上的應(yīng)用尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)研究了光化學(xué)衍生的實(shí)驗(yàn)條件，建立了簡(jiǎn)便，可靠，靈敏度高的動(dòng)物組織中磺胺藥物殘留的檢測(cè)方法。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

Agilent1260高效液相色譜儀配熒光檢測(cè)器（美國(guó)Agilent公司）；光化學(xué)衍生器（由紫外燈（11 W）、聚四氟乙烯反應(yīng)管（25 m×0.25 mm）組成，北京華安麥科公司）；高速勻漿機(jī)（德國(guó)IKA公司）；高速離心機(jī)（美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國(guó)IKA公司）；氮?dú)獯蹈蓛x（天津市恒奧科技有限公司）；渦旋混合器（太倉(cāng)市華利達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

甲醇、乙腈（色譜級(jí)， 德國(guó)Merck公司）；甲酸、正己烷（色譜級(jí)， 美國(guó)TEDIA公司）；實(shí)驗(yàn)用水為MilliQ超純水。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：磺胺嘧啶（純度≥99.5%），磺胺噻唑（純度≥99.5%），磺胺甲基嘧啶（純度≥99.2%），磺胺吡啶（純度≥99.0%），磺胺二甲基嘧啶（純度≥99.0%），磺胺對(duì)甲氧嘧啶（純度≥98.0%），磺胺氯噠嗪（純度≥99.0%），磺胺甲氧噠嗪（純度≥99.2%），磺胺二甲異噁唑（純度≥98.0%），磺胺苯甲酰（純度≥99.0%），磺胺喹噁啉（純度≥98.0%）。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均購(gòu)于德國(guó)Dr. Ehrenstorfer GmbH公司。

3.2高效液相色譜條件的優(yōu)化

參考磺胺檢測(cè)的相關(guān)文獻(xiàn)[9～11]，使用甲醇、乙腈、乙酸溶液三相作為流動(dòng)相，對(duì)比了甲醇、乙腈為有機(jī)相與含不同濃度的乙酸溶液組成的流動(dòng)相對(duì)磺胺藥物分離的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不含酸的流動(dòng)相，磺胺的藥物的色譜峰形出現(xiàn)拖尾，部分組分重疊。加入乙酸后，色譜峰形對(duì)稱(chēng)，分離效果好?？疾炝瞬煌瑵舛纫宜釋?duì)色譜峰形的影響，發(fā)現(xiàn)0.2% 乙酸既能保證較好的分離效果，同時(shí)也不影響色譜柱的使用壽命。由于乙腈的洗脫能力較強(qiáng)，磺胺藥物在色譜柱上的保留時(shí)間短，部分磺胺分離度較差，甲醇的洗脫能力較弱，分離度好，但是磺胺藥物的保留時(shí)間較長(zhǎng)，且峰型較扁平。采用合適的甲醇、乙腈、乙酸可得到較好的分離度和較快的分離效率。優(yōu)化后的色譜分離條件見(jiàn)2.2節(jié)，11種磺胺的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖見(jiàn)圖1。

3.3前處理方法的建立

比較了甲醇、乙腈、乙酸乙酯的提取效果。甲醇的提取效率較低，也不易沉淀蛋白。乙酸乙酯提取有利于下一步的處理，但是提取物的脂肪含量較高，除脂過(guò)程很容易損失目標(biāo)物。乙腈的提取效率較高，而且提取液的脂肪含量較少，處理也相對(duì)方便。乙腈提取液帶入的少量脂肪可以用正己烷去除，盡量減少基質(zhì)的干擾，圖2為凈化后空白樣品和加標(biāo)樣品的色譜圖。

3.5回收率和精密度

對(duì)陰性豬肉樣品進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，添加水平分別為定量限的3倍和5倍，采用優(yōu)化后的前處理方法對(duì)樣品進(jìn)行處理，每個(gè)添加水平重復(fù)6次，各磺胺的平均回收率在85.7%～101.1%之間，RSD為1.9%～6.6%，詳見(jiàn)表2。

3.6實(shí)際樣品測(cè)定

利用本方法測(cè)定了購(gòu)于農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)的10個(gè)豬肉樣品中的磺胺類(lèi)藥物殘留量。在10個(gè)樣品中，僅有1例樣品檢出磺胺二甲嘧啶，測(cè)得量為24.5 μg/kg （n=3）。結(jié)果表明，本方法相比于常規(guī)化學(xué)試劑衍生檢測(cè)法具有綠色、環(huán)保、靈敏度高、穩(wěn)定性好的優(yōu)點(diǎn)，適用于肌肉組織中磺胺藥物殘留的檢測(cè)。

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