鄧新云，羅躍中，顏 鑫，劉小忠

（湖南化工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 株洲 412004）

檸檬酸(citric acid)，又名枸櫞酸，是一種三元羧酸，其學(xué)名為3-羥基-3-羧基戊二酸，在自然界中分布廣泛，主要存在于檸檬、柑橘、梅子等果實(shí)中?，F(xiàn)在檸檬酸被廣泛應(yīng)用于食品、飲料、醫(yī)藥、化工、冶金等領(lǐng)域[1-2]，全球的年產(chǎn)量超過(guò)100 萬(wàn)t，而且年需求量仍在以3.5% 4%的速度增長(zhǎng)[3]。目前檸檬酸的發(fā)酵菌株主要以黑曲霉為主，故而所用菌株的產(chǎn)酸能力是影響現(xiàn)代檸檬酸發(fā)酵生產(chǎn)關(guān)鍵因素。目前野生型菌種的檸檬酸產(chǎn)量相對(duì)較低。如何利用各種誘變手段選育高產(chǎn)脂肪酶生產(chǎn)菌一直是國(guó)內(nèi)外研究的重點(diǎn)。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外有些對(duì)檸檬酸發(fā)酵菌種的選育研究報(bào)道[4-6]。本研究利用紫外線(xiàn)對(duì)初篩菌株(Aspergillus niger)YZ-35 進(jìn)行物理誘變來(lái)提高其產(chǎn)酸能力，以獲得具有應(yīng)用價(jià)值的工業(yè)生產(chǎn)菌株。

本研究以初篩性?xún)r(jià)比較高的產(chǎn)檸檬酸菌株為出發(fā)菌，經(jīng)紫外線(xiàn)誘變處理，改進(jìn)和提升其產(chǎn)酸率及耐酸度。同時(shí)對(duì)改良后的優(yōu)勢(shì)菌的發(fā)酵條件進(jìn)行單因素初步研究，旨在進(jìn)一步優(yōu)化現(xiàn)代檸檬酸發(fā)酵工藝基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株

前期篩選得到的黑曲霉(Aspergillus niger)YZ-35，由湖南化工職業(yè)技術(shù)學(xué)院國(guó)家生物制藥基地保藏。

1.2 主要儀器和設(shè)備

UV-2550 紫外分光光度計(jì)、電子天平、電爐、蒸汽滅菌鍋、恒溫水浴箱（LDZX-50FAS）、超凈工作臺(tái)、全溫空氣搖床（QYC-21）、生化培養(yǎng)箱（HPS-250）。

1.3 主要化學(xué)試劑

葡 萄 糖（CP），NH4NO3（AR），K2HPO4（AR），溴甲酚綠（AR），MgSO4·7H2O（AR），硫酸二乙酯（AR），醋酐（AR），酒石酸鉀鈉（AR）等。

1.4 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，葡萄糖15g，瓊脂20g，加水1000mL，pH 值自然。

固體平板培養(yǎng)基：葡萄糖5%、NH4NO33g·L-1、K2HPO41.0g·L-1、溴甲酚綠0.05%、瓊脂20g·L-1。

發(fā)酵培養(yǎng)基：甘薯(粉)50g·L-1、葡萄糖50g·L-1、NH4Cl 3.0g·L-1、KH2PO41.0g·L-1、MgSO4·7H2O 0.20g·L-1。

1.5 試驗(yàn)方法

1.5.1 懸浮液制備

用生理鹽水制備菌懸液，加入玻璃珠振蕩分散，分散程度達(dá)90%以上。同時(shí)用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，控制孢子濃度為106108個(gè)孢子·mL-1。

1.5.2 檸檬酸總酸度測(cè)定

采用NaOH 滴定法[7]。

1.5.3 紫外線(xiàn)誘變方法

采取無(wú)菌操作將黑曲霉孢子配成105108個(gè)·mL-1的菌懸液。各取10mL 處理好的菌懸液放入14 個(gè)無(wú)菌培養(yǎng)皿中，依次放置于距30W 紫外燈30cm 處的磁力攪拌器上，打開(kāi)培養(yǎng)皿蓋并開(kāi)啟磁力攪拌器，分別照射0s（對(duì)照）、20s、40s、60s、80s、100s、120s（做2 組平行樣）。在暗光環(huán)境下，分別取經(jīng)紫外線(xiàn)誘變的菌懸液0.2mL 涂布于14 個(gè)固體平板培養(yǎng)基上，包扎后倒置于35℃恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)3d[8]。誘變菌株經(jīng)培養(yǎng)后，挑取菌落較大且厚的菌株，編號(hào)并接入試管斜面保存，同時(shí)取對(duì)應(yīng)的菌株活化后接種到250mL 搖瓶中，置于35℃、180r·min-1搖床發(fā)酵培養(yǎng)5d，對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行分析并選取優(yōu)勢(shì)菌株。

1.5.4 發(fā)酵條件初步研究

采用單因素實(shí)驗(yàn)，分別研究發(fā)酵溫度、起始pH、初始糖量、接種量及發(fā)酵時(shí)間對(duì)優(yōu)勢(shì)菌株發(fā)酵產(chǎn)酸的影響并找到最佳發(fā)酵條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外線(xiàn)誘變篩選結(jié)果

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)有些平板上菌落較少且小，也有不長(zhǎng)孢子菌落，說(shuō)明此菌對(duì)紫外線(xiàn)比較敏感。從固體鑒別培養(yǎng)基上選取透明圈直徑(C)/菌落直徑（d）比值較大的菌株，接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于37℃、150r·min-1搖床培養(yǎng)5d，測(cè)定發(fā)酵液中檸檬酸含量，以出發(fā)菌株黑曲霉(Aspergillus niger)YZ-35為對(duì)照，具體結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 紫外線(xiàn)誘變后部分菌株的C/d 值與總酸度

紫外線(xiàn)誘變屬于非電離輻射，作用機(jī)理是將被處理的物質(zhì)分子或原子中的內(nèi)層電子提高能級(jí)，致使DNA 鏈和氫鍵斷裂等生物學(xué)效應(yīng)，從而提高檸檬酸產(chǎn)量[9]。由表1 可知，C/d 值與產(chǎn)酸量呈正相關(guān)，C/d 值越大，所對(duì)應(yīng)的產(chǎn)酸能力越強(qiáng)。試驗(yàn)結(jié)果表明，UV-5 產(chǎn)酸率最高，達(dá)到8.46%，比原始菌株(Aspergillus niger)YZ-35 提高了24.41%。故選擇UV-5 作為下一步發(fā)酵條件研究的出發(fā)菌株。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 發(fā)酵溫度對(duì)菌株UV-5 產(chǎn)酸率的影響

發(fā)酵溫度對(duì)菌株發(fā)酵的影響如圖1 所示。由圖1 可見(jiàn)，溫度對(duì)該菌發(fā)酵影響顯著。當(dāng)溫度低于25℃時(shí)，產(chǎn)酸率是隨著溫度的升高而逐漸增加。發(fā)酵溫度在32 38℃之間產(chǎn)酸率相對(duì)穩(wěn)定，當(dāng)溫度達(dá)到35℃時(shí)，產(chǎn)酸率達(dá)到最佳，達(dá)到13.08%(v/v)，之后隨著溫度的升高而降低。但發(fā)酵溫度高于40℃時(shí)，該菌的發(fā)酵力顯著下降，可能是因?yàn)榇罅康奶怯糜诤铣删w和氧化成CO2和H2O，產(chǎn)酸率也會(huì)相對(duì)降低[10]。

圖1 發(fā)酵溫度對(duì)菌株UV-5 產(chǎn)酸率的影響

2.2.2 初始pH 對(duì)菌株UV-5 產(chǎn)酸率的影響

檸檬酸主要發(fā)酵菌黑曲霉是嗜酸性微生物，黑曲霉在生長(zhǎng)和發(fā)酵檸檬酸不同階段需要不同的pH值條件，黑曲霉生長(zhǎng)的最適pH 值在3 7 之間。初始pH 值對(duì)黑曲霉產(chǎn)檸檬酸的影響很大，特別是在發(fā)酵初期菌絲體生長(zhǎng)期，如初始pH 值太高或太低都會(huì)抑制菌絲體的生長(zhǎng)，進(jìn)而會(huì)影響到檸檬酸產(chǎn)量。初始pH 對(duì)菌株發(fā)酵的影響結(jié)果如圖2 所示。由圖2 可看出，UV-5 菌在pH 值為3.5 6.5 的范圍內(nèi)都能產(chǎn)酸，在pH=5.5 時(shí)達(dá)到最高。

2.2.3 初始糖量對(duì)菌株UV-5 產(chǎn)酸率的影響

菌株UV-5 在不同初始糖濃度中發(fā)酵情況如圖3 所示。UV-5 在低濃度的葡萄糖中都能較好生長(zhǎng)，

圖2 初始pH 對(duì)菌株UV-5 產(chǎn)酸率的影響

圖3 初始糖濃度對(duì)菌株UV-5 產(chǎn)酸率影響

2.2.4 轉(zhuǎn)速對(duì)菌株UV-5 產(chǎn)酸率的影響

檸檬酸發(fā)酵時(shí)，需要在發(fā)酵液中維持一定的溶解氧量。通風(fēng)和攪拌是增加培養(yǎng)基內(nèi)溶解氧的主要方法。隨著菌體生成，發(fā)酵液中的溶解氧會(huì)逐漸降低，從而抑制了檸檬酸的合成。不同轉(zhuǎn)速對(duì)產(chǎn)酸率的影響結(jié)果如圖4 所示。

圖4 不同轉(zhuǎn)速對(duì)菌株UV-5 產(chǎn)酸率影響

由圖4 可以看出，轉(zhuǎn)速對(duì)產(chǎn)酸率影響較為顯著。當(dāng)轉(zhuǎn)速140 r·min-1時(shí)，產(chǎn)酸率最高，為12.90%。隨著菌體生成，發(fā)酵液中的溶解氧會(huì)逐漸降低，從而抑制了檸檬酸的合成。增加培養(yǎng)液中溶解氧對(duì)產(chǎn)酸有利。但轉(zhuǎn)速過(guò)快，會(huì)產(chǎn)生過(guò)大的剪切力，損傷細(xì)胞而導(dǎo)致產(chǎn)量下降。因此，最佳轉(zhuǎn)速140r·min-1。

2.2.5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株UV-5 產(chǎn)酸率的影響

發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株UV-5 產(chǎn)酸率影響結(jié)果如圖5所示。由圖5 可知，發(fā)酵時(shí)間在36 72h，產(chǎn)酸率隨著發(fā)酵時(shí)間的增加而增高，并在84h 內(nèi)達(dá)到最大。在72 96h 內(nèi)，檸檬酸產(chǎn)酸率維持較高水平，超過(guò)96h 后，發(fā)酵能力下降。考慮到生產(chǎn)成本等因素，選擇培養(yǎng)時(shí)間以84h 為宜。

圖5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株UV-5 產(chǎn)酸率影響

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)紫外線(xiàn)誘變篩選出的多株優(yōu)勢(shì)菌，以UV-5 產(chǎn)酸率最高，達(dá)到8.46%，比原始菌株(Aspergillus niger)YZ-35 提高了24.41%，說(shuō)明紫外線(xiàn)誘變對(duì)黑曲霉菌種選育較為敏感且效果好。菌株UV-5 以紅薯為發(fā)酵原料，在初始糖濃度15%、溫度為35℃、起始pH 值為6，轉(zhuǎn)速140r·min-1、發(fā)酵84h 的條件下，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)菌種UV-5 搖瓶發(fā)酵平均產(chǎn)酸率可達(dá)到13.15%。

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