張榮秋，董純明，盛華芳，白秀花，矯立萍，劉金祿，汪衛(wèi)國，周宏偉，邵宗澤＊

（1.國家海洋局 第三海洋研究所 海洋生物遺傳資源重點實驗室，福建 廈門361005；2.國家海洋局 第三海洋研究所海洋－大氣化學(xué)與全球變化重點實驗室，福建 廈門361005；3.國家海洋局 第三海洋研究所 海洋與海岸地質(zhì)環(huán)境實驗室，福建 廈門361005；4.南方醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生與熱帶醫(yī)學(xué)學(xué)院環(huán)境衛(wèi)生系，廣東 廣州510515）

1 引言

多 環(huán) 芳 烴 （polycyclic aromatic hydrocarbon，PAH）是陸地向海洋中輸入的重要持久性污染物之一，由于它對哺乳動物具有致畸、致癌和致突變的特性，美國環(huán)保局將其列為優(yōu)先治理的環(huán)境污染物［1—2］。環(huán)境中PAHs污染的治理，除使用物理化學(xué)的方法外，生物修復(fù)的方法越來越受到重視。目前，海洋環(huán)境中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種能夠降解PAHs的細(xì)菌，如解環(huán)菌Cycloclasticus、新鞘氨醇桿菌Novosphingobium、海桿菌Marinobacter、假交替單胞菌Pseudoalteromonas、假單胞菌Pseudomonas和海神單胞菌屬Neptunomonas等［3—4］。

由于PAHs化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，易在環(huán)境中長期殘留，所以在“全球蒸餾效應(yīng)”的作用下，能夠從人類活動地區(qū)向北極遷移［5—9］。有研究表明，北極地區(qū)動物體內(nèi)、陸地土壤、海洋沉積物中均能檢測到PAHs［10—11］。北極地區(qū)常年低溫，影響了PAHs的生物利用性，同時由于氣候環(huán)境條件惡劣導(dǎo)致采樣困難，所以相比于其他海洋環(huán)境，有關(guān)北極地區(qū)PAHs降解微生物的研究報道較少，且多集中在極地的陸地土壤環(huán)境中，優(yōu)勢降解菌以Pseudomonas為主［12—14］。而有關(guān)極地海洋表層沉積物中PAHs降解微生物種群的研究，特別是白令海至楚科奇海大尺度范圍內(nèi)，海洋表層沉積物中PAHs降解菌種群結(jié)構(gòu)的研究還未見報道。

本研究以萘、菲、芘為唯一碳源和能源，對采自白令海至楚科奇海8個站位的14個表層沉積物進行了富集，并通過平板分離的可培養(yǎng)手段，及DGGE和Illumina高通量測序的非培養(yǎng)手段分析了降解菌群的結(jié)構(gòu)，并對其中可培養(yǎng)菌株的PAHs降解能力進行了初步的研究。

2 材料和方法

2.1 材料

2.1.1 樣品采集

2010年7—9月，“雪龍”號破冰船在執(zhí)行中國第四次北極科學(xué)考察期間，白令海和楚科奇海8個站位的14份表層沉積物樣品被采集。除B07站位樣品由多管采泥器采集外，其他樣品均由箱式采泥器采集。樣品信息見圖1和表1。

圖1 采樣站位

表1 白令海和楚科奇海表層沉積物采樣站位

2.1.2 培養(yǎng)基

降解菌群富集用NH培養(yǎng)基配制方法參考文獻(xiàn)［4］，但使用原位海水替代實驗室陳海水。降解菌分離用的M8培養(yǎng)基參考文獻(xiàn)［15］配制。

2.1.3 引物

細(xì)菌16S r RNA基因擴增引物，16SF（5’－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3’），16SR （5’－ACGGCTACCTTGTTACGACT －3’）；Box－PCR 引物，BOXA1R （5’－ CTACGGCAAGGCGACGCTGACG－3’）；PCR－DGGE引物，V3F （5’－CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGG GGGGCCTACGGGAGGCAGCAG－3’）；V3R （5’－ATTACCGCGGCTGCTGG－3’）；細(xì)菌16Sr RNA V6區(qū)Illumina高通量測序Barcode引物967F（5’－NNNNNNNNGTCNACGCGAAGAACCTTANC－3’），1046R（5’－GCATTCGACAGCCATGCANCACCT－3’）。

2.1.4 主要試劑及儀器

萘（純度大于99.8%）購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；菲和芘（純度大于97%）購自Sigma－Aldrich公司；PCR相關(guān)試劑購自Fer mentas公司；恒溫?fù)u床和超凈工作臺（上海智誠分析儀器制造有限公司）；生化培養(yǎng)箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；AlphaInnotech凝膠成像儀（SanLeandro，California）；PCR擴增儀（Bio－Rad）；Decode System 電泳儀（Bio－Rad公司）；p GEM? －T Easy Vector Systems（Promega）。

2.2 沉積物中PAHs含量分析

沉積物中PAHs的抽提、純化、GC－MS定量分析方法參考文獻(xiàn)［15］，其中美國環(huán)保局推薦優(yōu)先治理的16種PAHs被定量分析，定量方法采用內(nèi)標(biāo)法。

2.3 PAH降解菌的富集和分離鑒定

14份沉積物樣品在船上采集后，分別取5 g接種于250 mL NH富集培養(yǎng)基中，并補加1 mL內(nèi)含PAHs的原油（萘、菲、芘在培養(yǎng)基中終濃度分別為：200、100和50 mg／L），于4℃靜置避光培養(yǎng)（約2～3個月）?；貙嶒炇液?，取10 mL富集物轉(zhuǎn)接到100 mL新鮮的NH培養(yǎng)基中，并補加PAHs混合物（終濃度同上），25℃，150 r／min避光培養(yǎng)4周。隨后，富集物梯度稀釋涂布M2培養(yǎng)基平板，25℃避光培養(yǎng)2周后，挑取不同形態(tài)的單菌落，在M2平板上劃線純化兩次后保藏菌種，同時收集部分菌體用于基因組DNA的抽提。

2.4 細(xì)菌DNA提取和系統(tǒng)進化分析

菌株及菌群基因組DNA的提取按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書進行。同一站位分離的菌株利用BOX－PCR（94℃，4 min；94℃，15 s，53℃，30 s，65℃，8 min，共35個循環(huán)；65℃，25 min）剔除重復(fù)菌株。剩余菌株的16Sr RNA基因被擴增、測序并提交NCBI Blast N 和 EzBio Cloud網(wǎng)站（http：／／eztaxon－e.ezbiocloud.net／）進行系統(tǒng)發(fā)育分析；最后用 MEGA（version 4.0）軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹（Neighbor－Joining算法）。

2.5 富集菌群結(jié)構(gòu)的PCR－DGGE和Illumina高通量測序分析

富集菌群16S r RNA基因V3區(qū)擴增、純化和DGGE電泳分析，亮帶切膠回收，測序過程參考文獻(xiàn)［15］。同時，我們利用細(xì)菌16S r RNA基因V6區(qū)barcode引物擴增各個富集菌群的16Sr RNA基因V6區(qū)，PCR產(chǎn)物純化后等摩爾比混合后，提交Illumina HiSeq2000測序平臺進行Pair－end（100 bp）測序分析。測序后高通量數(shù)據(jù)分析采用BIPES流程，read的聚類采用TSC算法［16－17］，并以97%的序列相似性作為OTU劃分的標(biāo)準(zhǔn)，read系統(tǒng)發(fā)育地位的確定采用GAST（Global Alignment for Sequence Taxonomy）方法［18－19］。菌群聚類分析采用 PRI MER （v6.1.5）軟件；CA分析使用Canoco（V4.5）軟件。

2.6 可培養(yǎng)菌株P(guān)AH降解能力驗證

從平板上刮取新鮮的菌株培養(yǎng)物，接種于50 mL內(nèi)含PAHs混合物的NH培養(yǎng)基中，25℃，150 r／min培養(yǎng)3周，通過測定細(xì)胞濃度（OD600），及觀察比較培養(yǎng)物顏色變化情況來判斷菌株是否利用PAHs。

3 結(jié)果

3.1 沉積物中PAHs定量分析

GC－MS定量結(jié)果表明，14個表層沉積物中PAHs總干質(zhì)量介于32.99～276.97 ng／g（見表1），海盆區(qū)（白令海）表層沉積物中PAHs含量高于陸架區(qū)（白令海和楚科奇海），所有樣品中3環(huán)及3環(huán)以下PAHs的量占PAHs總量的90%以上。菲和芴分別是每個樣品中含量最高的兩種PAHs。

3.2 可培養(yǎng)菌株的分離鑒定與系統(tǒng)進化分析

4℃富集菌群轉(zhuǎn)接到25℃培養(yǎng)4周后，14個富集菌群中分離獲得51株細(xì)菌。系統(tǒng)進化分析表明它們分屬于γ－proteobacteria，α－proteobacteria，Actinobacteria，F(xiàn)ir micutes和Bacteroidetes門中的17個屬（見圖2）。其中γ－proteobacteria門是優(yōu)勢類群，占可培養(yǎng)菌株總數(shù)的58.82%，它們多歸屬于Marinobacter、Halomonas、Pseudoalteromonas和Pseudomonas屬；Actinobacteria門占19.61%，主要種屬是Dietzia、Salinibacterium和Isoptericol a；歸屬于α－proteobacteria、Bacteroidetes和Fir micutes門菌株的比例較小，分別是7.84%、7.84%和5.88%?？傮w上而言，Marinobacter是25℃富集菌群中優(yōu)勢屬，占可培養(yǎng)菌株總數(shù)的29.41%。

圖2 富集菌群中可培養(yǎng)菌株的16Sr RNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹

3.3 菌株P(guān)AH降解能力驗證

將富集菌群中可培養(yǎng)菌株接種于補加PAHs的NH培養(yǎng)基中，3周后觀察其生長情況（見表2）。菌株以3種PAHs為碳源和能源生長的情況表明，共有7株菌可單獨利用PAHs生長，其中2株迪茨氏菌（Dietzia）都具有很好的降解效果。

表2 可培養(yǎng)菌株對PAHs降解能力的驗證

3.4 菌群組成的PCR－DGGE分析

為了分析PAHs降解菌群的種群組成，我們以25℃富集菌群的總DNA為模板，利用細(xì)菌16Sr RNA基因V3區(qū)引物進行擴增，獲得長約200 bp的擴增產(chǎn)物，隨后進行變性梯度凝膠電泳（DGGE）分析（圖3）。通過對菌群中亮帶的切膠回收、克隆測序和比對分析，鑒定亮帶所對應(yīng)的菌株，從而解析菌群中的優(yōu)勢菌株。

圖3 PAHs降解菌群組成的DGGE分析

DGGE結(jié)果表明，14個菌群中除R06d和B07u等2個菌群結(jié)構(gòu)較為簡單外，其余12個菌群中亮帶均較多，這說明PAHs降解菌群中細(xì)菌種群多樣性較高（圖3）。14個菌群中所有切膠測序的79個亮帶對應(yīng)的最近緣菌株共來自26個細(xì)菌屬，包括γ變形菌門的Marinobacter，Pseudoalteromonas，Pseudomonas，Halomonas，Thal assolituus，Oceanisphaer a，Coclei monas，Rhodanobacter，Methylophaga，Alcanivor ax和Marinomonas；α變形菌門的Sinor hizobium，Roseovarius，Sul f itobacter，Sphingosinicella，Methylobacterium；β變形菌門的Achromobacter；CFB類群的Maribacter，Bacillus，Salegentibacter，Muricauda和Sedi minicol a；以 及 Actinobacteria門 的Dietzia，Nocar dioides，Salinibacterium和Saccharothrix。上述種屬中有12個獲得了純培養(yǎng)菌株，這包括γ變形菌門的Marinobacter，Halomonas，Pseudoalteromonas，Pseudomonas，Alcanivorax和Oceanisphaer a；α變形菌門的Sul f itobacter；CFB 類 群 的Bacill us，Maribacter和Muricauda，以及Actinobacteria門的Salinibacterium和Dietzia。

3.5 菌群結(jié)構(gòu)的Illumina高通量測序分析

為了進一步分析14個降解菌群的種群結(jié)構(gòu)，我們利用Illu mina HiSeq2000測序平臺，采用Pair－end 100 bp測序策略，對菌群中細(xì)菌16S V6高變區(qū)進行了高通量測序。14個菌群共獲得172 410條reads，去除低質(zhì)量reads及嵌合體（Chi mera）后，共獲得149 838條Clean reads（約61 bp），平均每個菌群獲得10 700條Clean reads，隨后這些Clean reads被用于種群結(jié)構(gòu)分析。聚類分析結(jié)果表明，這些Clean reads歸屬于15 455個Unique，5 585個OTU（見表3）。多樣性指數(shù)結(jié)果表明，來自白令海盆及陸架富集菌群的多樣性指數(shù)較高，如B04站位；而來自楚科奇海的較低，如R06站位。

表3 富集菌群Illumina高通量測序結(jié)果及多樣性評估

3.5.1 稀釋度曲線

稀釋度曲線顯示，所有菌群中檢測到的OTU（97%序列相似度）數(shù)目介于200～600個（圖4）；同時，所有菌群的覆蓋率介于72%～87.1%，這些結(jié)果說明14個PAHs富集菌群中細(xì)菌多樣性豐富。相比較而言，B04u和B04d兩個菌群中微生物多樣性最豐富，其稀釋度曲線還未趨于飽和。

圖4 PAHs降解菌群的稀釋度曲線

3.5.2 種群結(jié)構(gòu)聚類分析

14個菌群的聚類和CA分析均表明，所有14個富集菌群可以分為2個類群：陸架類群（Bering and Chukchi Shelves）和海盆類群（Bering Basin）。陸架類群中包括9個來自水深較淺的白令海和楚科奇海陸架；而海盆類群的5個菌群均來自水深較深的白令海海盆（圖5A）。CA分析結(jié)果表明，除B07u菌群外，陸架和海盆兩個類群能夠很好地被PC2軸區(qū)分（variable value＝23.8%），特別是9個來自陸架區(qū)的菌群在CA結(jié)果中高度集中（圖5B），這表明這9個菌群的結(jié)構(gòu)存在較高的相似性。相反，4個來自海盆區(qū)的菌群在CA結(jié)果中分布的較分散。

圖5 PAHs降解菌群結(jié)構(gòu)的聚類分析

3.5.3 種群結(jié)構(gòu)分析

在所有14個測序菌群的149 838條Reads中，屬于Proteobacteria門的reads占絕對優(yōu)勢（75.5%），而分列第二位和第三位Actinobacteria和Fir micutes門的比例僅為12.5%和9.5%。除B02u、B04u、B07d和NB02d站位外，γ變形菌群的細(xì)菌是各個富集菌群中的優(yōu)勢類群，特別是在陸架區(qū)的降解菌群中，比例更是高達(dá)66.4%。

14個菌群共檢測到232個屬，豐度最高的10個屬依次是：Pseudomonas，Marinobacter，Halomonas，Bacillus，Pseudoalteromonas，Sul f itobacter，Shewanell a，Leif sonia，Dietzia和Roseovarius（見圖6）。但具體到每個菌群，種屬組成變化較大，例如已報道的PAHs降解菌Pseudomonas主要集中在陸架區(qū)的NB02u、CC1u、CC1d和 R09u站位；Marinobacter主要在集中在陸架區(qū)的BB05u、R06u、R06d和R09d站位；Pseudoalteromonas則主要集中在陸架區(qū)的BB05u、CC1u、CC1d和R09u站位；Dietzia則主要集中在陸架區(qū)的B07d站位；Halomonas多分布在B07u、NB02u和R09d站位。此外，我們也發(fā)現(xiàn)了海洋專屬的PAHs降解菌Cycloclasticus，它多分布在陸架區(qū)的富集菌群中（0.01%～7.74%），特別是在BB05u站位中比例高達(dá)7.7%。

圖6 富集菌群在屬水平上相對豐富分析

4 討論

北極地區(qū)相對于其他環(huán)境，受人類活動影響較小，雖然環(huán)境受污染程度較輕，但是持久性有機污染物能夠通過“全球蒸餾效應(yīng)”在極地冷卻沉降，本研究也從白令海至楚科奇海表層沉積物中檢測到多種PAHs，這為PAHs降解菌的存在提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。但是，相比于近海環(huán)境，本研究中14個表層沉積物中16種PAHs總量遠(yuǎn)低于近岸環(huán)境［20—22］。

平板純培養(yǎng)、PCR－DGGE和Illumina高通量測序結(jié)果都表明，14個菌群中優(yōu)勢的降解菌主要是γ變形菌門的Marinobacter，Pseudoalteromonas，Pseudomonas和Actinobacteria門的Dietzia菌；然而，多數(shù)近海和大洋環(huán)境中優(yōu)勢的PAHs降解菌多是Cyclocl asticus，Novosphingobium和Pseudomonas［4，15，23—25］。前期對北極地區(qū)土壤中PAHs降解菌群的研究發(fā)現(xiàn)，Pseudomonas往往是菌群中的優(yōu)勢菌［12—14］，所以推測本研究中PAHs降解菌群中的Pseudomonas可能是隨陸源河水輸入到白令海和楚科奇海中。Pseudoalteromonas菌代謝功能多樣，是極地等低溫環(huán)境中常見的可培養(yǎng)類群，也經(jīng)常被發(fā)現(xiàn)于極地來源的石油及PAHs降解菌群中［26—29］，所以其在本研究的降解菌群中是優(yōu)勢種屬符合前期研究結(jié)果。Marinobacter菌是海洋環(huán)境中專屬的烴類降解菌［30］，前期已有報道證實在北極石油污染的海冰中Marinobacter是其中重要的類群［31］，同時近期也有研究表明它可以降解PAHs［32］，所以我們的結(jié)果暗示了它和Pseudomonas菌可能是北極低溫環(huán)境中重要的PAHs降解菌。此外，放線菌門的Dietzia菌雖然不是降解菌群中優(yōu)勢的種屬，但單菌降解實驗結(jié)果表明，它們對PAHs具有一定的降解效果（表2）。

在進行降解菌群結(jié)構(gòu)分析時，雖然PCR－DGGE是經(jīng)典的方法，但是它只能檢測到菌群中豐度大于1%的類群［33］。而Illumina測序技術(shù)能夠提供更高的測序通量和深度，能夠發(fā)現(xiàn)菌群中豐度更低（＜0.01%）的種屬。如本研究中用純培養(yǎng)和PCRDGGE技術(shù)分別獲得了17和26個細(xì)菌屬，而通過Illumina高通量測序技術(shù)，共檢測到232個細(xì)菌屬，這其中包括多種純培養(yǎng)及PCR－DGGE技術(shù)未檢測到的PAHs降解菌，如：Cycloclasticus，Sphingopyxis，Alteromonas，Neptunomonas和Sphingomonas等。以上結(jié)果暗示了，多種類型的PAHs降解菌存在于北極表層沉積物中，但僅有少量能夠長期適應(yīng)北極特殊環(huán)境的PAHs降解菌成為降解菌群中的優(yōu)勢類群。

5 結(jié)論

白令海及楚科奇海表層沉積物中PAHs總干質(zhì)量介于32.99～276.97 ng／g，且呈現(xiàn)由深海海盆向陸架降低的趨勢。純培養(yǎng)、PCR－DGGE及Illu mina高通量測序結(jié)果均表明，該區(qū)域中優(yōu)勢的PAHs降解菌是Marinobacter，Pseudoalteromonas，Pseudomonas和Dietzia。此外，Illumina高通量測序結(jié)果還表明14個降解菌群在結(jié)構(gòu)組成上，可分為海盆區(qū)和陸架區(qū)兩種類群；同時降解菌群中也存在一些低豐度的海洋專屬PAHs降解菌，如Cycloclasticus，Alteromonas和Neptunomonas等。

［1］Baird C.Environmental Chemistry［M］.New York：W H.Freeman and Company，1995：276—278.

［2］Bezalel L，Hadar Y，F(xiàn)u P P，et al.Cerniglia CE：Initial Oxidation Products in the Metabolism of Pyrene，Ant hracene，F(xiàn)luorene，and Dibenzothiophene by t he White Rot Fungus Pleurotus ostreatus［J］.Applied and environ mental microbiology，1996，62（7）：2554—2559.

［3］Head I M，Jones D M，Roling W F M.Marine microorganisms make a meal of oil［J］.Nature Reviews Microbiology，2006，4（3）：173—182.

［4］Dong C，Chen L，Liao Y.Phylogenetic and degrading genes analysis of a PAHdegrading bacterium TVG9－Ⅶfrom deep－sea hydryther mal environment［J］.Acta Microbiologica Sinica，2011，51（11）：1548—1554.

［5］Goldberg E D.Synthetic organohalides in the sea［J］.Proc R Soc Lond B Biol Sci，1975，189（1096）：277—289.

［6］Fried man C L，Selin N E.Long－range at mospheric transport of polycyclic aromatic hydrocar bons：a global 3－D model analysis including evaluation of Arctic sources［J］.Environmental science ＆technology，2012，46（17）：9501—9510.

［7］Ding X，Wang X M，Xie Z Q，et al.At mospheric polycyclic aromatic hydrocarbons observed over the North Pacific Ocean and the Arctic area：Spatial distribution and source identification［J］.At mospheric Environment，2007，41：2061—2072.

［8］Halsall C，Barrie L，Jones K，et al.Modelling the behaviour of PAHs during at mospheric transport from the UK to the Arctic［J］.At mospheric Environ ment，2001，35（2）：255—267.

［9］Wania F，Mackay D.Peer reviewed：tracking the distribution of persistent organic pollutants［J］.Environmental science ＆technology，1996，30（9）：390 A—396 A.

［10］Wang Z，Ma X，Na G，et al.Correlations bet ween physicochemical properties of PAHs and their distribution in soil，moss and reindeer dung at Ny－Alesund of the Arctic［J］.Environ Pollut，2009，157（11）：3132—3136.

［11］Hung H，Blanchard P，Halsall C J，et al.Temporal and spatial variabilities of at mospheric polychlorinated biphenyls（PCBs），organochlorine（OC）pesticides and polycyclic aromatic hydrocarbons（PAHs）in the Canadian Arctic：results from a decade of monitoring［J］.The Science of t he total environ ment，2005，342（1－3）：119—144.

［12］Whyte L G，Bourbonniere L，Greer C W.Biodegradation of petroleu m hydrocarbons by psychrotrophicPseudomonasstrains possessing both alkane（alk）and naphthalene（nah）catabolic pathways［J］.Applied and environmental microbiology，1997，63（9）：3719—3723.

［13］Sorensen S R，Johnsen A R，Jensen A，et al.Presence of psychrotolerant phenanthrene－mineralizing bacterial populations in contaminated soils from the Greenland High Arctic［J］.FEMS microbiology letters，2010，305（2）：148—154.

［14］Eriksson M，Sodersten E，Yu Z，et al.Degradation of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons at Low Temperature under Aerobic and Nitrate－Reducing Conditions in Enrichment Cultures from Northern Soils［J］.Applied and environmental microbiology，2003，69（1）：275—284.

［15］Cui Z，Lai Q，Dong C，et al.Biodiversity of polycyclic aromatic hydrocarbon－degrading bacteria from deep sea sediments of the Middle Atlantic Ridge［J］.Environ mental Microbiology，2008，10（8）：2138—2149.

［16］Zhou H W，Li D F，Tam N F，et al.BIPES，a cost－effective high－t hroughput method for assessing microbial diversity［J］.ISME J，2011，5（4）：741—749.

［17］Jiang X T，Zhang H，Sheng H F，et al.Two－stage clustering（TSC）：a pipeline for selecting operational taxonomic units for the high－throughput sequencing of PCR amplicons［J］.PloS one，2012，7（1）：e30230.

［18］Huse S M，Dethlefsen L，Huber J A，et al.Exploring microbial diversity and taxonomy using SSU r RNA hypervariable tag sequencing［J］.PLoS genetics，2008，4（11）：e1000255.

［19］Sogin M L，Morrison H G，Huber J A，et al.Microbial diversity in t he deep sea and t he underexplored“rare biosphere”［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2006，103（32）：12115—12120.

［20］Baumard P，Budzinski H，Garrigues P.Polycyclic aromatic hydrocarbons in sediments and mussels of the western Mediterranean Sea［J］.Environ Toxicol Chem，1998，17（5）：765—776.

［21］Pereira W E，Hostettler F D，Rapp J B.Distribution and fate of chlorinated insecticides，biomarkers and polycyclic aromatic hydrocarbons in sediments along a contamination gradient from a point－source in San Francisco Bay，California［J］.Mar Environ Res，1996，41：299—314.

［22］Witt G.Polycyclic aromatic hydrocarbons in water and sediment of the Baltic Sea［J］.Marine pollution bulletin，1995，31：237—248.

［23］Wang B，Lai Q，Cui Z，et al.A pyrene－degrading consortiu m from deep－sea sediment of t he West Pacific and its key memberCycloclasticussp.P1［J］.Environ Microbiol，2008，10（8）：1948—1963.

［24］Cui Z，Shao Z.Predominant strains of polycyclic aromatic hydrocarbon－degrading consortia from deep sea of the Middle Atlantic Ridge［J］.Actamicrobiologica Sinica，2009，49（7）：902—909.

［25］Hilyard E J，Jones－Meehan J M，Spargo B J，et al.Enrichment，isolation，and phylogenetic identification of polycyclic aromatic hydrocar bon－degrading bacteria from Elizabeth River sedi ments［J］.Appl Environ Microbiol，2008，74（4）：1176—1182.

［26］Giudice A L，Bruni V，Domenico M D，et al.Psychrophiles－cold－adapted hydrocarbon－degrading microorganisms［M］.Berlin：Springer，2010：1897—1921.

［27］林學(xué)政，沈繼紅，杜寧，等.北極海洋沉積物石油降解菌的篩選及系統(tǒng)發(fā)育分析［J］.環(huán)境科學(xué)學(xué)報，2009，29（3）：536—541.

［28］Lin X，Yang B，Shen J，et al.Biodegradation of crude oil by an arctic psychrotrophic bacteriumPseudoalteromomassp.P29［J］.Current microbiology，2009，59（3）：341—345.

［29］張月梅，祖國仁，那廣水，等.北極耐冷石油降解菌的篩選、鑒定及其碳源利用廣譜性［J］.海洋環(huán)境科學(xué)，2010，29（2）：216—220.

［30］Yaki mov M M，Timmis K N，Golyshin P N.Obligate oil－degrading marine bacteria［J］.Curr Opin Biotechnol，2007，18（3）：257—266.

［31］Deppe U，Richnow H H，Michaelis W，et al.Degradation of cr ude oil by an arctic microbial consortiu m［M］.Extremophiles：life under extreme conditions，2005，9（6）：461—470.

［32］Gao W，Cui Z，Li Q，et al.Marinobacternanhaiticussp.nov.，polycyclic aromatic hydrocarbon－degrading bacteriu m isolated from t he sedi ment of the Sout h China Sea［J］.Antonie van Leeuwenhoek，2012.

［33］Muyzer G，de Waal E C，Uitterlinden A G.Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction－amplified genes coding for 16S RNA［J］.Appl Environ Microbiol，1993，59（3）：695—700.