王志雄等

[摘要] 目的 研究桑葉對(duì)腫瘤血管生成中血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和管腔形成的影響。 方法 用CCK-8試劑盒測(cè)定HUVEC-2C細(xì)胞數(shù)量的變化；用Transwell轉(zhuǎn)移小室研究HUVEC-2C細(xì)胞遷移情況；用包被Matrigel的24孔板來(lái)培養(yǎng)HUVEC-2C細(xì)胞觀察其管腔形成情況。實(shí)驗(yàn)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組分別設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，在實(shí)驗(yàn)組中加入桑葉浸出液。觀察桑葉對(duì)腫瘤血管生成的影響。 結(jié)果 桑葉液可抑制HUVEC-2C細(xì)胞的增殖能力，抑制作用隨著濃度的增長(zhǎng)而增強(qiáng)。在濃度為100、50、25 mg/mL時(shí)，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。當(dāng)濃度為100 mg/mL的桑葉液時(shí)細(xì)胞增殖抑制率可達(dá)到37.6%。通過(guò)觀察Transwell小室，與對(duì)照組比較，添加了桑葉液的HUVEC-2C細(xì)胞，其遷移能力受到一定的制約作用。Matrigel實(shí)驗(yàn)中，與未加入桑葉液的HUVEC-2C細(xì)胞所形成的較完整的環(huán)狀結(jié)構(gòu)比較，加入桑葉液的HUVEC-2C細(xì)胞在管腔形成方面受到明顯的抑制作用。 結(jié)論 桑葉液通過(guò)抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和管腔形成，對(duì)腫瘤血管的生成具有抑制作用。

[關(guān)鍵詞] 桑葉；腫瘤血管；內(nèi)皮細(xì)胞；增殖；遷移；管腔形成

[中圖分類(lèi)號(hào)] R282.71 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2014）09（a）-0022-04

[Abstract] Objective To study the influence of mulberry on vascular endothelial cell proliferation and migration as well as lumen forming in tumor angiogenesis. Methods The change of HUVEC-2C cell quantity was measured with CCK-8 kit； HUVEC-2C cell migration was studied in Transwell chamber； HUVEC-2C cells were cultured in a 24-pore plate coated with Matrigel to observe its lumen forming. The experiment consisted of experiment group and control group， with three complex holes set for each group. Mulberry leachate was added to the experiment group. The effect of mulberry leaf to tumor angiogenesis was observed. Results Mulberry leachate could inhibit the proliferation ability of HUVEC-2C cell， with the inhibiting effect strengthened as the concentration increases. When the concentration was 100， 50， 25 mg/mL， the difference between the experiment group and the control group had statistical significance （P < 0.05）. When the concentration was 100 mg/mL， the cell proliferation inhibiting ratio of mulberry leachate could reach 37.6%. Observation on Transwell chamber showed the follows： added with mulberry leachate， the HUVEC-2C cells′migration ability was inhibited to some extent compared with the control group. In Matrigel experiment， compared with the comparatively complete cyclic structure formed by HUVEC-2C cells without mulberry leachate， the HUVEC-2C cells added with mulberry leachate were obviously inhibited in term of lumen forming. Conclusion Mulberry leachate has inhibiting effect on tumor angiogenesis by inhibiting vascular endothelial cell proliferation and migration as well as lumen forming.

[Key words] Mulberry leaf； Tumor angiogenesis； Endothelial cells； Proliferation； Migration； Lumen formation

1971年，F(xiàn)olkman[1]首次提出血管生成與腫瘤生長(zhǎng)之間的關(guān)系問(wèn)題。隨后許多研究陸續(xù)證明，腫瘤形成初期，腫瘤細(xì)胞能夠通過(guò)彌散方式獲取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。但長(zhǎng)到一定大小后，必須從最近的血管處誘導(dǎo)形成自身血管。如果沒(méi)有血管生成這一過(guò)程，腫瘤就會(huì)因得不到足夠的營(yíng)養(yǎng)和氧氣而進(jìn)入休眠階段，甚至壞死[1]。血管為腫瘤生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)和氧氣，也是其排泄的通道，更是轉(zhuǎn)移的必要條件[2]。這就為治療腫瘤提供了一個(gè)新思路——通過(guò)阻斷腫瘤血管的生長(zhǎng)，切斷腫瘤營(yíng)養(yǎng)與氧氣的供應(yīng)，從而抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。腫瘤血管與正常血管存在很大差異，但無(wú)論是腫瘤血管還是正常的血管，血管內(nèi)皮細(xì)胞（endothelial cell）都是血管的主要組成部分，襯貼于血管內(nèi)壁。

目前，市場(chǎng)上銷(xiāo)售的血管生成抑制藥物大都成本高昂，作用途徑比較單一，治療不夠徹底，副作用仍然較大，在實(shí)際應(yīng)用中存在一些問(wèn)題。近年來(lái)，隨著人民生活水平的提高，飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化，世界各地相關(guān)學(xué)者專(zhuān)家都在極力尋求天然、安全、保健性食品藥品的開(kāi)發(fā)，這種回歸自然的愿望已成為走向21世紀(jì)的趨勢(shì)。探尋引起不良反應(yīng)小的植物成分藥已成為血管生成抑制劑發(fā)展的重要方向[3]。特別是低價(jià)易得植物材料，不但可以解決惡性腫瘤早期防治問(wèn)題，同時(shí)也可充分降低治療成本，給更多癌癥患者提供更大的生存機(jī)會(huì)。

桑葉，作為古老的中藥，其味甘、性平、寒，具有清肝明目聰耳，鎮(zhèn)靜神經(jīng)，潤(rùn)肺熱，止咳的作用。近年來(lái)，有關(guān)學(xué)者致力于對(duì)天然、安全、保健性藥食品的開(kāi)發(fā)，通過(guò)對(duì)桑葉化學(xué)成分及生理功能的研究，發(fā)現(xiàn)其含有的黃酮類(lèi)、生物堿等生物活性成分，具有降血糖、降血壓、降血脂、抗炎、抗衰老等功效，還能預(yù)防腫瘤細(xì)胞的生成[4-8]，被國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)列為藥食兩用植物。特別是類(lèi)黃酮中的槲皮素能夠抑制多種腫瘤細(xì)胞的分裂增殖，通過(guò)多種途徑促進(jìn)其凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞遷移及侵襲，降低其耐藥性等作用[9-13]。筆者從血管生成抑制方面來(lái)研究桑葉中有效成分對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響。

本課題通過(guò)探討低價(jià)易得植物材料桑葉中的有效成分對(duì)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移以及管腔形成的作用，來(lái)探索其對(duì)腫瘤血管生成的抑制作用，判斷桑葉有效成分抑制腫瘤血管生成的可行性，從而為腫瘤早期預(yù)防和治療提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

桑葉（日本株式會(huì)社黑姬和漢藥研究所）；HUVEC-2C（Cascade biologics公司，批號(hào)C-003-2C）；PBS（pH為7.4，實(shí)驗(yàn)室配制）；DMEM高糖培養(yǎng)基（Biowest公司提供）；細(xì)胞消化液（Trypsin 0.25%-EDTA 0.02%，Biowest公司提供）；胎牛血清（South America Origin，Biowest公司提供）；雙抗（青霉素-鏈霉素，碧云天生物研究所提供）；CCK-8（上海博谷公司）；Matrigel（威格拉斯生物公司提供）。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

超凈工作臺(tái)（SW-CJ-1B，蘇州安泰）；電子天平（FA2104，上海舜宇恒平）；二氧化碳培養(yǎng)箱（CP-ST100A，長(zhǎng)沙長(zhǎng)錦科技）；超聲處理儀（JY92-ⅡDN，寧波新芝生物科技股份有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（RE-52CS，上海雅榮生公司）；酶標(biāo)儀（DNM-9602G北京普朗公司）；倒置生物顯微鏡（LWD200-37T，上海測(cè)維光電）等。鑷子；手套；無(wú)菌針管；0.22 μm針頭過(guò)濾器；2 mL PE試管；50 mL離心管；燒杯；量筒；雙蒸水；培養(yǎng)皿；離心管；25 mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶（Corning）；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（Corning）；3 mL巴氏吸管（Corning）；Transwell轉(zhuǎn)移小室（Corning）；血球計(jì)數(shù)器。

1.3 方法

1.3.1 桑葉有效成分的提取[14-15] 精確稱(chēng)取桑葉粉3.00 g，浸泡于60 mL 75%的乙醇中。在50℃、20～25 kHz超聲頻率下超聲30 min后過(guò)濾，并將濾渣用60 mL 75%的乙醇再次超聲30 min。將得到的兩次濾液合并超聲混勻，再用0.45 μm的濾紙過(guò)濾。濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在0.08 mPa、60℃的環(huán)境下蒸發(fā)2.5 h以去除乙醇，得到的溶液定容至30 mL。之后使用0.22 μm的一次性針頭過(guò)濾器過(guò)濾除菌，最終得到的桑葉液濃度為100 mg/mL，依次兩倍梯度稀釋至50、25、12.5 mg/mL。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)中HUVEC-2C用配制好的DMEM高糖培養(yǎng)基（含10%胎牛血清，1%雙抗）進(jìn)行培養(yǎng)，用含0.25%胰蛋白酶（0.02% EDTA）消化傳代。二氧化碳培養(yǎng)箱環(huán)境設(shè)置為5%CO2，37℃。

1.3.3 增殖實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HUVEC-2C，進(jìn)行消化、計(jì)數(shù)，控制細(xì)胞數(shù)量至5×104個(gè)/mL。在96孔板中設(shè)實(shí)驗(yàn)組（100、50、25、12.5 mg/mL）、陽(yáng)性對(duì)照組、陰性對(duì)照組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，在實(shí)驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組中分別加入每孔100 μL的細(xì)胞懸液，陰性對(duì)照組加入100 μL培養(yǎng)基。在96板內(nèi)培養(yǎng)HUVEC-2C 8 h直至細(xì)胞完全貼壁。在實(shí)驗(yàn)組中分別加入10 μL不同濃度桑葉制備液（100、50、25、12.5 mg/mL），陽(yáng)性對(duì)照組、陰性對(duì)照組加入10 μL無(wú)血清的培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h之后將96孔板置于倒置顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞無(wú)異常生長(zhǎng)情況，再在每孔中加入10 μL CCK-8檢測(cè)試劑，1 h后用酶標(biāo)儀在單波長(zhǎng)450 nm處檢測(cè)OD值。OD值與細(xì)胞密度成正比，OD值越大說(shuō)明細(xì)胞密度越大，反之則越小。

1.3.4 遷移實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HUVEC-2C，進(jìn)行消化、重懸后計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞數(shù)量至1×106/mL。在Transwell轉(zhuǎn)移小室的上室每孔加入200 μL細(xì)胞懸液，下室加600 μL無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基。細(xì)胞培養(yǎng)8 h后，在實(shí)驗(yàn)組的下室加100 μL濃度為100 mg/mL的桑葉浸出液，對(duì)照組加100 μL無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。將Transwell轉(zhuǎn)移小室置于5%CO2，37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h后，用PBS清洗小室內(nèi)側(cè)，棉球擦去上室內(nèi)側(cè)中的細(xì)胞。小室外側(cè)細(xì)胞用無(wú)水酒精固定30 min，結(jié)晶紫染色30 min。洗凈后置于倒置生物顯微鏡下觀察、拍照并分析。

1.3.5 管腔形成實(shí)驗(yàn) 用每孔100 μL的Matrigel包被24孔板，室溫下放置30 min使Matrigel凝固。取出對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVEC-2C，消化、重懸后計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞數(shù)量至5×105/mL。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組每孔接種500 μL細(xì)胞懸液。此外，對(duì)照組不加桑葉浸出液，實(shí)驗(yàn)組加50 μL濃度為100 mg/mL的桑葉浸出液，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。將24孔板放入5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，8 h后置于倒置生物顯微鏡下觀察，隨機(jī)選3個(gè)視野拍照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中細(xì)胞增殖的抑制率（%）=1-實(shí)驗(yàn)組/對(duì)照組×100%。

2 結(jié)果

3 討論

正常環(huán)境下，血管生成是一個(gè)高度有序的過(guò)程，只有生長(zhǎng)組織有所需求時(shí)，才會(huì)誘導(dǎo)單層靜態(tài)內(nèi)皮細(xì)胞分化及血管網(wǎng)絡(luò)伸展。而腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)模擬正常血管生成過(guò)程形成自身血供。腫瘤血管生成主要是通過(guò)分泌促血管生長(zhǎng)因子，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞異常增殖、遷移和形成管腔[16]。

桑葉液具有抑制內(nèi)皮細(xì)胞系增殖的能力，抑制作用隨著濃度的增長(zhǎng)而增強(qiáng)。通過(guò)觀察Transwell小室，與對(duì)照組相比添加了桑葉液的內(nèi)皮細(xì)胞系，其遷移能力受到一定的制約作用。Matrigel實(shí)驗(yàn)中，與未加入桑葉液的內(nèi)皮細(xì)胞系所形成的較完整的環(huán)狀結(jié)構(gòu)相比，加入桑葉液的內(nèi)皮細(xì)胞系在管腔形成方面受到明顯的抑制作用。實(shí)驗(yàn)表明，桑葉液通過(guò)抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和管腔形成，對(duì)腫瘤血管的生成具有抑制作用，從而為其制約腫瘤血管生成、切斷營(yíng)養(yǎng)與氧氣供給和廢棄物排泄通道、促使腫瘤細(xì)胞凋亡提供有力佐證。本研究為桑葉在腫瘤早期預(yù)防和治療中的應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，使腫瘤早期防治和低成本治療成為可能。

關(guān)于本研究只進(jìn)行了大量的定性實(shí)驗(yàn)，得出桑葉具有抑制血管生成的功效，具體程度尚不明確，且桑葉中的有效組分未知，在之后的研究中將就以上兩個(gè)方面進(jìn)一步給予探討。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Folkman J. Tumor angiogenesis： therapeutic implications [J]. The New England Journal of Medicine，1971，285（21）：1182-1186.

[2] Kerbel RS. Tumor angiogenesis：past， present and the near future [J]. Carconogenesis，2000，（21）：505.

[3] 徐韜，許瑞安.中藥及其有效成分抗腫瘤作用機(jī)制研究進(jìn)展[J].華僑大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，30，（4）：359-365.

[4] 張舉，肖更生，聊森泰，等.桑葉綜合利用進(jìn)展[J].廣東蠶業(yè)，2003，4（1）：38-41.

[5] 王芳，勵(lì)建榮.桑葉的化學(xué)成分、生理功能及應(yīng)用研究進(jìn)展[J].食品科學(xué)，2005，26（1）：111-116.

[6] 歐陽(yáng)臻，陳鈞.桑葉的化學(xué)成分及其藥理作用研究進(jìn)展[J].江蘇大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2003，24（6）：39-43.

[7] 何雪梅，廖森泰，劉吉平.桑葉的營(yíng)養(yǎng)功能性成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].蠶業(yè)科學(xué)，2004，30（4）：390-393.

[8] 張春麗.中藥對(duì)腫瘤血管生成抑制作用的研究[J].北京中醫(yī)藥，2011，30（2）：156-160.

[9] Wachter J，Neureiter D，Alinger B，et al. Influence of five potential anticancer drugs on wnt pathway and cell survival in human biliary tract cancer cells [J]. Int J Bid Sci，2012，8（1）：15-29.

[10] Qin Y，He LY，Chen Y，et al. Quercetin affects leptin and its receptor in human gastric cancer MGC-803 cells and JAKSTAT pathway [J]. Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi，2012，28（1）：12-16.

[11] Senthilkumar K，Arunkumar R，Elumalai P，et al. Quercetin inhibits invasion，migration and signalling molecules involved in cell survival and proliferation of prostate cancer cell line （PC-3） [J]. Cell Biochem Funct，2011，29（2）：87-95.

[12] Borska S，Chmielewska M，Wysocka T，et al. In vitro effect of quercetin on human gastric carcinoma：Targeting cancer cells death and MDR [J]. Food Chem Toxicol，2012，50（9）：3375-3383.

[13] 蘇維詞.槲皮素的癌化學(xué)預(yù)防作用研究進(jìn)展[J].中草藥，2001，32（4）：380-381.

[14] 張軍.桑葉有效成分提取與分析[D].合肥：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004.

[15] 陳叢瑾，黃克瀛，李德良，等.植物中黃酮類(lèi)化合物的提取方法研究概況[J].生物質(zhì)化學(xué)工程，2007，41（3）：42-46.

[16] 馬嵋，張燕，張玲，等.人胃癌細(xì)胞株裸鼠皮下移植瘤模型的建立及其生物學(xué)特性[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2012，20（6）：57-60.

（收稿日期：2014-05-21 本文編輯：衛(wèi) 軻）

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中細(xì)胞增殖的抑制率（%）=1-實(shí)驗(yàn)組/對(duì)照組×100%。

2 結(jié)果

3 討論

正常環(huán)境下，血管生成是一個(gè)高度有序的過(guò)程，只有生長(zhǎng)組織有所需求時(shí)，才會(huì)誘導(dǎo)單層靜態(tài)內(nèi)皮細(xì)胞分化及血管網(wǎng)絡(luò)伸展。而腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)模擬正常血管生成過(guò)程形成自身血供。腫瘤血管生成主要是通過(guò)分泌促血管生長(zhǎng)因子，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞異常增殖、遷移和形成管腔[16]。

桑葉液具有抑制內(nèi)皮細(xì)胞系增殖的能力，抑制作用隨著濃度的增長(zhǎng)而增強(qiáng)。通過(guò)觀察Transwell小室，與對(duì)照組相比添加了桑葉液的內(nèi)皮細(xì)胞系，其遷移能力受到一定的制約作用。Matrigel實(shí)驗(yàn)中，與未加入桑葉液的內(nèi)皮細(xì)胞系所形成的較完整的環(huán)狀結(jié)構(gòu)相比，加入桑葉液的內(nèi)皮細(xì)胞系在管腔形成方面受到明顯的抑制作用。實(shí)驗(yàn)表明，桑葉液通過(guò)抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和管腔形成，對(duì)腫瘤血管的生成具有抑制作用，從而為其制約腫瘤血管生成、切斷營(yíng)養(yǎng)與氧氣供給和廢棄物排泄通道、促使腫瘤細(xì)胞凋亡提供有力佐證。本研究為桑葉在腫瘤早期預(yù)防和治療中的應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，使腫瘤早期防治和低成本治療成為可能。

關(guān)于本研究只進(jìn)行了大量的定性實(shí)驗(yàn)，得出桑葉具有抑制血管生成的功效，具體程度尚不明確，且桑葉中的有效組分未知，在之后的研究中將就以上兩個(gè)方面進(jìn)一步給予探討。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Folkman J. Tumor angiogenesis： therapeutic implications [J]. The New England Journal of Medicine，1971，285（21）：1182-1186.

[2] Kerbel RS. Tumor angiogenesis：past， present and the near future [J]. Carconogenesis，2000，（21）：505.

[3] 徐韜，許瑞安.中藥及其有效成分抗腫瘤作用機(jī)制研究進(jìn)展[J].華僑大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，30，（4）：359-365.

[4] 張舉，肖更生，聊森泰，等.桑葉綜合利用進(jìn)展[J].廣東蠶業(yè)，2003，4（1）：38-41.

[5] 王芳，勵(lì)建榮.桑葉的化學(xué)成分、生理功能及應(yīng)用研究進(jìn)展[J].食品科學(xué)，2005，26（1）：111-116.

[6] 歐陽(yáng)臻，陳鈞.桑葉的化學(xué)成分及其藥理作用研究進(jìn)展[J].江蘇大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2003，24（6）：39-43.

[7] 何雪梅，廖森泰，劉吉平.桑葉的營(yíng)養(yǎng)功能性成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].蠶業(yè)科學(xué)，2004，30（4）：390-393.

[8] 張春麗.中藥對(duì)腫瘤血管生成抑制作用的研究[J].北京中醫(yī)藥，2011，30（2）：156-160.

[9] Wachter J，Neureiter D，Alinger B，et al. Influence of five potential anticancer drugs on wnt pathway and cell survival in human biliary tract cancer cells [J]. Int J Bid Sci，2012，8（1）：15-29.

[10] Qin Y，He LY，Chen Y，et al. Quercetin affects leptin and its receptor in human gastric cancer MGC-803 cells and JAKSTAT pathway [J]. Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi，2012，28（1）：12-16.

[11] Senthilkumar K，Arunkumar R，Elumalai P，et al. Quercetin inhibits invasion，migration and signalling molecules involved in cell survival and proliferation of prostate cancer cell line （PC-3） [J]. Cell Biochem Funct，2011，29（2）：87-95.

[12] Borska S，Chmielewska M，Wysocka T，et al. In vitro effect of quercetin on human gastric carcinoma：Targeting cancer cells death and MDR [J]. Food Chem Toxicol，2012，50（9）：3375-3383.

[13] 蘇維詞.槲皮素的癌化學(xué)預(yù)防作用研究進(jìn)展[J].中草藥，2001，32（4）：380-381.

[14] 張軍.桑葉有效成分提取與分析[D].合肥：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004.

[15] 陳叢瑾，黃克瀛，李德良，等.植物中黃酮類(lèi)化合物的提取方法研究概況[J].生物質(zhì)化學(xué)工程，2007，41（3）：42-46.

[16] 馬嵋，張燕，張玲，等.人胃癌細(xì)胞株裸鼠皮下移植瘤模型的建立及其生物學(xué)特性[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2012，20（6）：57-60.

（收稿日期：2014-05-21 本文編輯：衛(wèi) 軻）

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中細(xì)胞增殖的抑制率（%）=1-實(shí)驗(yàn)組/對(duì)照組×100%。

2 結(jié)果

3 討論

正常環(huán)境下，血管生成是一個(gè)高度有序的過(guò)程，只有生長(zhǎng)組織有所需求時(shí)，才會(huì)誘導(dǎo)單層靜態(tài)內(nèi)皮細(xì)胞分化及血管網(wǎng)絡(luò)伸展。而腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)模擬正常血管生成過(guò)程形成自身血供。腫瘤血管生成主要是通過(guò)分泌促血管生長(zhǎng)因子，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞異常增殖、遷移和形成管腔[16]。

桑葉液具有抑制內(nèi)皮細(xì)胞系增殖的能力，抑制作用隨著濃度的增長(zhǎng)而增強(qiáng)。通過(guò)觀察Transwell小室，與對(duì)照組相比添加了桑葉液的內(nèi)皮細(xì)胞系，其遷移能力受到一定的制約作用。Matrigel實(shí)驗(yàn)中，與未加入桑葉液的內(nèi)皮細(xì)胞系所形成的較完整的環(huán)狀結(jié)構(gòu)相比，加入桑葉液的內(nèi)皮細(xì)胞系在管腔形成方面受到明顯的抑制作用。實(shí)驗(yàn)表明，桑葉液通過(guò)抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和管腔形成，對(duì)腫瘤血管的生成具有抑制作用，從而為其制約腫瘤血管生成、切斷營(yíng)養(yǎng)與氧氣供給和廢棄物排泄通道、促使腫瘤細(xì)胞凋亡提供有力佐證。本研究為桑葉在腫瘤早期預(yù)防和治療中的應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，使腫瘤早期防治和低成本治療成為可能。

關(guān)于本研究只進(jìn)行了大量的定性實(shí)驗(yàn)，得出桑葉具有抑制血管生成的功效，具體程度尚不明確，且桑葉中的有效組分未知，在之后的研究中將就以上兩個(gè)方面進(jìn)一步給予探討。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Folkman J. Tumor angiogenesis： therapeutic implications [J]. The New England Journal of Medicine，1971，285（21）：1182-1186.

[2] Kerbel RS. Tumor angiogenesis：past， present and the near future [J]. Carconogenesis，2000，（21）：505.

[3] 徐韜，許瑞安.中藥及其有效成分抗腫瘤作用機(jī)制研究進(jìn)展[J].華僑大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，30，（4）：359-365.

[4] 張舉，肖更生，聊森泰，等.桑葉綜合利用進(jìn)展[J].廣東蠶業(yè)，2003，4（1）：38-41.

[5] 王芳，勵(lì)建榮.桑葉的化學(xué)成分、生理功能及應(yīng)用研究進(jìn)展[J].食品科學(xué)，2005，26（1）：111-116.

[6] 歐陽(yáng)臻，陳鈞.桑葉的化學(xué)成分及其藥理作用研究進(jìn)展[J].江蘇大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2003，24（6）：39-43.

[7] 何雪梅，廖森泰，劉吉平.桑葉的營(yíng)養(yǎng)功能性成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].蠶業(yè)科學(xué)，2004，30（4）：390-393.

[8] 張春麗.中藥對(duì)腫瘤血管生成抑制作用的研究[J].北京中醫(yī)藥，2011，30（2）：156-160.

[9] Wachter J，Neureiter D，Alinger B，et al. Influence of five potential anticancer drugs on wnt pathway and cell survival in human biliary tract cancer cells [J]. Int J Bid Sci，2012，8（1）：15-29.

[10] Qin Y，He LY，Chen Y，et al. Quercetin affects leptin and its receptor in human gastric cancer MGC-803 cells and JAKSTAT pathway [J]. Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi，2012，28（1）：12-16.

[11] Senthilkumar K，Arunkumar R，Elumalai P，et al. Quercetin inhibits invasion，migration and signalling molecules involved in cell survival and proliferation of prostate cancer cell line （PC-3） [J]. Cell Biochem Funct，2011，29（2）：87-95.

[12] Borska S，Chmielewska M，Wysocka T，et al. In vitro effect of quercetin on human gastric carcinoma：Targeting cancer cells death and MDR [J]. Food Chem Toxicol，2012，50（9）：3375-3383.

[13] 蘇維詞.槲皮素的癌化學(xué)預(yù)防作用研究進(jìn)展[J].中草藥，2001，32（4）：380-381.

[14] 張軍.桑葉有效成分提取與分析[D].合肥：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004.

[15] 陳叢瑾，黃克瀛，李德良，等.植物中黃酮類(lèi)化合物的提取方法研究概況[J].生物質(zhì)化學(xué)工程，2007，41（3）：42-46.

[16] 馬嵋，張燕，張玲，等.人胃癌細(xì)胞株裸鼠皮下移植瘤模型的建立及其生物學(xué)特性[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2012，20（6）：57-60.

（收稿日期：2014-05-21 本文編輯：衛(wèi) 軻）