戴柳江，張 卉，李夢(mèng)怡，席 可，郭增軍（西安交通大學(xué)藥學(xué)院，西安 710061）

半 仿 生－酶 法 （semi－bionic enzyme extraction，SBEE）是將半仿生提取法與生物酶提取結(jié)合起來(lái)提取中藥藥效物質(zhì)的一種新方法。該法模擬口服給藥及藥物經(jīng)胃腸道轉(zhuǎn)運(yùn)的原理，將藥材在常溫、常壓下，選擇適當(dāng)?shù)拿高M(jìn)行酶解，破壞其細(xì)胞壁，以不同pH的水為溶劑對(duì)藥材進(jìn)行連續(xù)提取得到含指標(biāo)成分較高“活性混合物”的一種新型提取方法［1］。該方法是在半仿生基礎(chǔ)上加入生物酶進(jìn)行酶解，是半仿生法的進(jìn)一步仿生［2］。

文獻(xiàn)報(bào)道，有研究者曾用半仿生－酶法對(duì)三萜皂苷類［2－6］、糖苷 類［7］、酚 酸 類［8－9］及 黃 酮 類［10－11］都 做 過(guò)相關(guān)的研究。通過(guò)運(yùn)用該法對(duì)復(fù)方藥與單味藥研究的結(jié)果表明，與其他傳統(tǒng)溶劑提取方法相比，半仿生－酶法提取不同有效成分都顯示出一定優(yōu)勢(shì)。例如：王淑玲［2］、孫福東［3］在運(yùn)用不同溶劑法提取半夏白術(shù)天麻湯方藥成分時(shí)，以SBEE法為佳。楊光義等［8］運(yùn)用半仿生法、酶法及半仿生－酶法提取丹參水溶性成分的比較研究，發(fā)現(xiàn)半仿生－纖維素酶法所得綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)最優(yōu)。雒馨怡等［10］通過(guò)對(duì)鹿銜草總黃酮的酶聯(lián)半仿生法提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后所得總黃酮提取率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)醇提所得。為了進(jìn)一步研究半仿生－酶法在不同中藥及不同成分中的應(yīng)用，作者選取甘草、槐米和黃連3種藥材作為半仿生－酶法的研究對(duì)象，分別以3種藥材中的主要成分甘草酸、蘆丁和小檗堿含量以及各自的總浸膏得率為指標(biāo)，先通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化得到3種藥材半仿生－酶法的最佳工藝條件，再通過(guò)將半仿生－酶法最佳工藝下3種成分的含量與水提法、酶法、半仿生法和傳統(tǒng)醇提法所得含量進(jìn)行比較，研究半仿生－酶法對(duì)上述不同有效成分的提取效果，初步確定半仿生－酶法的適用范圍。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 CS1011型電熱鼓風(fēng)干燥箱（重慶實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）；PHS－3C型pH計(jì)（上海佑科儀器儀表有限公司）；Mettler AE240 電 子 天 平 （Mettler－Toledo Group）；KQ3200B型超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）；SHZ－D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵（河南鞏義英峪予華儀器廠）；Thermo Spectra System P2000高效液相色譜儀（美國(guó) Thermo公司）；DK－98－IIA型電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；UV－1800型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津公司）。

1.2 試藥 3種藥材均購(gòu)于西安市藥材市場(chǎng)，經(jīng)郭增軍教授鑒定甘草為豆科植物甘草（Glycyrrhiza uraiensis Fisch）的干燥根及根莖，槐米為豆科植物槐（Sophora japonica L.）的干燥花蕾，黃連為毛茛科植物黃連（Coptis chinensis Franch.）的干燥根莖；甘草酸（110731－201116）、蘆?。?00080－200707）、鹽酸小檗堿（110713－200609）對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；果膠酶（3×105U·g－1）、纖維素酶（3×104U·g－1）、β－葡聚糖酶（5×105U·g－1）均購(gòu)自寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司；色譜純乙腈（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；蒸餾水，自制三蒸水；乙醇、市售磷酸、十二水合磷酸氫二鈉、一水合檸檬酸均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.1.1 半仿生－酶法 根據(jù)仿生學(xué)原理，人體胃、小腸、大腸的體液pH 值為2.0，7.5和8.3。分別稱取各藥材10g，加檸檬酸－磷酸氫二鈉緩沖液適量，調(diào)pH值至2.0，50℃恒溫振蕩2h，然后調(diào)pH值至4.5，再加入適量的酶酶解50min，濾過(guò)，濾渣依次加入pH分別為7.5和8.3的磷酸氫二鈉－檸檬酸緩沖溶液作為提取液水浴提取，合并全部提取液，濃縮得到干浸膏。

2.1.2 半仿生－酶法正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化工藝 為了獲得各藥材半仿生－酶法的最佳工藝，在確定半仿生－酶法的操作步驟后，選定提取溫度、料液比和時(shí)間作為考察的3個(gè)因素，每個(gè)因素各取3個(gè)水平：水浴溫度（60，70和80℃），料液比（1∶10，1∶14和1∶18g· mL－1）提取時(shí)間（1.5，2.0和2.5h）。采用L9（34）正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以主成分含量和干浸膏收率的綜合評(píng)分（綜合評(píng)分＝主成分含量×4＋干浸膏收率×1）為考察指標(biāo)，考察因素間的最佳配比。

2.1.3 不同提取方法比較

（1）纖維素酶法 分別稱取各藥材10g，加水80mL，50℃恒溫振蕩2h，調(diào)pH值至4.5，再加入適量的纖維素酶，在50℃酶解50min，濾過(guò)，藥渣依次加入50mL蒸餾水，水浴提取2.5h（槐米為2h），合并提取液，濃縮得到干浸膏。

（2）水提法 分別稱取各藥材10g，分別加水80mL，50℃恒溫振蕩2h，繼續(xù)在50℃水浴提取50min，濾過(guò)，藥渣依次加入50mL蒸餾水，水浴提取2.5h（槐米為2h），合并提取液，濃縮得到干浸膏。

（3）半仿生法 稱取各藥材10g，加檸檬酸－磷酸氫二鈉緩沖液80mL，調(diào)pH值至2.0，50℃恒溫振蕩2h，繼續(xù)于50℃水浴提取50min，濾過(guò)，濾渣依次加入pH為7.5和8.3的磷酸氫二鈉－檸檬酸緩沖溶液50mL水浴提取2.5h（槐米為2h），合并提取液，濃縮得到干浸膏。

（4）傳統(tǒng)醇提法 分別稱取各藥材10g，用100mL體積分?jǐn)?shù)70%乙醇浸泡30min，加熱回流2h，濾過(guò)，藥渣再加入100mL體積分?jǐn)?shù)70%乙醇回流2h，濾過(guò)，合并2次濾液濃縮得到干浸膏。

2.1.4 干膏收率的計(jì)算 將上述不同方法所得各提取液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，蒸至近干后，轉(zhuǎn)移到蒸發(fā)皿中，于水浴鍋中揮干，再置于真空干燥箱中，60℃烘至恒質(zhì)量，于干燥器中冷卻30min，稱定質(zhì)量，即為提取物總量，計(jì)算干膏收率（干膏得率＝提取物總量／加入藥材干粉總量×100% ）。

2.1.5 有效成分含量的計(jì)算 通過(guò)計(jì)算得出各藥材中有效成分甘草酸、蘆丁和小檗堿的質(zhì)量，計(jì)算有效成分含量（有效成分含量＝測(cè)得的有效成分質(zhì)量／加入藥材干粉總量×100%）。

2.1.6 各方法比較的綜合評(píng)分計(jì)算 參見(jiàn)2.1.2中綜合評(píng)分計(jì)算公式。

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件

（1）甘草酸 Diamonsil TM C18（250mm×4.6mm，5μm），前加預(yù)柱（10mm×4.6mm）；UV檢測(cè)波長(zhǎng)：247nm；柱溫：室溫；流動(dòng)相：乙腈－0.5mL·L－1磷酸溶液 （40∶60）；流速：1.0mL·min－1。

（2）蘆丁 Promosil C18（L）（150mm×4.6mm，5μm），前加預(yù)柱（10mm×4.6mm）；UV 檢測(cè)波長(zhǎng)：257nm；柱溫：室溫；流動(dòng)相：甲醇－10mL·L－1磷酸溶液 （32∶68）；流速：1.0mL·min－1。

（3）鹽酸小檗堿 Promosil C18（L）（150mm×4.6mm，5μm），前加預(yù)柱（10mm×4.6mm）；UV檢測(cè)波長(zhǎng)：345nm；柱溫：室溫；流動(dòng)相：乙腈－0.05mol·L－1磷酸二氫鉀溶液 （50∶50）；流速：1.0mL·min－1。

2.2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取甘草酸對(duì)照品10mg，精密稱定，置于50mL量瓶中，用流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。分別精密稱取蘆丁和鹽酸小檗堿對(duì)照品1mg，精密稱定，置于10mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 供試品溶液制備 取按2.1.3項(xiàng)下得到的干浸膏適量，精密稱量，置于10mL量瓶中，定容，用0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，得供試品溶液。

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密稱取2.2.2項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液0.20，0.40，0.60，0.80，1.00和1.20mL，置于10mL量瓶中，用流動(dòng)相定容至刻度，搖勻；用0.45μm微孔濾膜過(guò)濾后，各精密吸取20μL，按照上述色譜條件測(cè)定。以進(jìn)樣質(zhì)量濃度C（μg·mL－1）為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到的甘草酸、蘆丁和鹽酸小檗堿的回歸方程分別為：

2.2.5 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取甘草酸、蘆丁和鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液，按上述色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，每次20μL，測(cè)定組分的峰面積，計(jì)算得到各成分的峰面積的RSD分別為0.89%，1.57% 和1.61%。

2.2.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 按2.2.3項(xiàng)下方法制備各供試品溶液6份，精密吸取20μL，按2.2.1項(xiàng)下條件測(cè)定，取平均值，結(jié)果甘草酸、蘆丁和鹽酸小檗堿質(zhì)量濃度的 RSD值分別為1.55%，1.78% 和1.39%。

2.2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 按照上述條件分別制備供試品溶液。精密吸取同一供試品溶液20μL，分別于0，2，4，6，8，10，12和24h測(cè)定，結(jié)果甘草酸、蘆丁和鹽酸小檗堿在24h內(nèi)質(zhì)量濃度穩(wěn)定。其RSD分別為1.65%，1.26%和1.23%，說(shuō)明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8 回收率實(shí)驗(yàn) 分別精密稱定已知含量的3種不同浸膏適量，用流動(dòng)相溶解后分別加入不同量的對(duì)照品溶液。按照2.2.3項(xiàng)下方法制備供試液，按2.2.1項(xiàng)下條件測(cè)定。分別取20μL 進(jìn)樣，進(jìn)行HPLC分析，記錄色譜圖，測(cè)定峰面積，計(jì)算其平均回收率分別為96.88%，100.75%和103.61%。

2.3 測(cè)定結(jié)果 3種藥材半仿生－酶法按2.1.2項(xiàng)進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化工藝，結(jié)果見(jiàn)表1至表3所示。

表1 甘草的半仿生－酶法正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Orthogonal design and results of licorice root by semi－bionic enzyme extraction

表2 槐米的半仿生－酶法正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Orthogonal design and results of sophora flower bud by semi－bionic enzyme extraction

表3 黃連的半仿生－酶法正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Orthogonal design and results of coptis by semi－bionic enzyme extraction

直觀分析上述結(jié)果，發(fā)現(xiàn)3種藥材的半仿生－酶法正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有一定重復(fù)性。在3種藥材的半仿生－酶法提取中，影響因素由大到小依次均為：B＞A＞C。用SPSS軟件對(duì)正交實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，甘草、槐米和黃連的半仿生－酶法的分析結(jié)果見(jiàn)表4。從方差分析結(jié)果可以看出，在提取槐米和黃連中有效成分時(shí)，因素B（料液比）對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響顯著（P＜0.05），而因素A（溫度）與C（提取時(shí)間）對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響不大。而各因素對(duì)甘草中有效成分的提取影響均不顯著。綜上，甘草和黃連的半仿生－酶法最佳條件均為A3B3C3，即水浴溫度為80℃，料液比為1∶18，提取時(shí)間為2.5h。而槐米的最佳工藝為A3B3C2，水浴溫度為80℃，料液比為1∶18，提取時(shí)間為2.0h。

表4 正交實(shí)驗(yàn)的方差分析結(jié)果Tab.4 Analytical results of variance

半仿生－酶法與各方法比較，結(jié)果見(jiàn)表5。結(jié)果顯示，對(duì)不同藥材的提取，與其他以水為溶劑的提取法相比，半仿生－酶法綜合評(píng)分最高，具有一定優(yōu)勢(shì)。不同藥材之間進(jìn)行比較，應(yīng)用半仿生－酶法提取甘草中有效成分得率更接近傳統(tǒng)醇提所得得率。

表5 半仿生－酶法與各方法比較的結(jié)果Tab.5 The results of different methods comparison

3 討論

本實(shí)驗(yàn)分析比較了半仿生－酶法在甘草、槐米、黃連等藥材中的應(yīng)用效果。本文的創(chuàng)新之處在于：第一，首次運(yùn)用半仿生－酶法提取3種藥材甘草、槐米和黃連。第二，運(yùn)用半仿生－酶法系統(tǒng)比較不同類別成分的提取，并將其與其他方法進(jìn)行對(duì)比研究。本實(shí)驗(yàn)所得結(jié)論可以為今后運(yùn)用半仿生－酶法提取不同類別成分提供一定參考依據(jù)。

在前期工作中，通過(guò)查閱文獻(xiàn)并進(jìn)行不同種類酶提比較，最后優(yōu)選了纖維素酶作為本次實(shí)驗(yàn)用酶。多篇文獻(xiàn)報(bào)道，纖維素酶適用于多種類型有效成分的提?。?2－14］。同時(shí)有文獻(xiàn)指出，在纖維素酶的作用下，部分甘草酸會(huì)水解［15］。也有研究者［16］曾對(duì)半仿生法提取甘草中甘草酸的工藝進(jìn)行過(guò)優(yōu)化，甘草酸收率與本實(shí)驗(yàn)中半仿生－酶法所得結(jié)果十分接近。纖維素酶的存在一方面增大了甘草酸的溶出率，另一方面又可能對(duì)其有一定分解作用?？傮w效果表現(xiàn)出與半仿生法得率接近。猜測(cè)其他成分如甘草酸分解產(chǎn)物甘草次酸的含量會(huì)有增加。而其他2種藥材槐米和黃連中主要成分分別為黃酮類和生物堿類，結(jié)果顯示其半仿生－酶法得率較低?？赡苁怯捎邳S酮類物質(zhì)極性較小，在以水為溶劑的方法中提取得率較低。這一結(jié)論與文獻(xiàn)報(bào)道不一致［10］，是后期工作中應(yīng)該重點(diǎn)研究的。而生物堿類化合物如小檗堿較易氧化分解，可能是由于當(dāng)采用半仿生－酶法提取該類化合物時(shí)濃縮得到浸膏后，小檗堿較長(zhǎng)時(shí)間暴露于空氣中被氧化，導(dǎo)致最后測(cè)得含量偏低。

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