張繼業(yè),楊范莉,童 華(.西安交通大學(xué)藥學(xué)院,西安 7006;2.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院,西安 7006)
丁香葉folium syringae來源于木犀科Oleaceae丁香屬Syringa植物紫丁香Syringa oblata Lindl.、朝鮮丁香Syringa diatata Nakai、洋丁香Syringa Vulgaris L.的干燥葉[1],具有抗菌消炎、抗病毒[2-3]、降壓、鎮(zhèn)咳祛痰、保肝護(hù)膽等作用[2,4-5],且毒副作用較小,其有效成分為原兒茶醛及原兒茶酸[2]。提取工藝研究是中藥有效成分研究的重要組成部分,本文以原兒茶醛及原兒茶酸為指標(biāo)成分初步地研究提取方法,并測定了有效成分的含量。
1.1 儀器 LC-10A 液相色 譜系統(tǒng),包 括 LC-10ATvp色譜泵,SPD-10Avp檢測器及CLASS-vp工作站(日本島津);TGL-16LC型離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。
1.2 試藥 紫丁香葉(西安市藥材市場,經(jīng)鑒定為藥典規(guī)定藥材);原兒茶酸(批號(hào)110809-200604)和原兒茶醛對照品(批號(hào)11810-200506)購自中國食品藥品檢定研究院;甲醇為色譜純;水為超純水;其余試劑為分析純。
2.1 原兒茶醛和原兒茶酸的含量測定方法 采用高效液相色譜法測定。色譜條件:色譜柱:Planetsil C18(150mm×4.6mm,5μm);流動(dòng)相:甲醇-水-冰醋酸(12∶78∶0.5);流速:1.0mL·min-1;檢測波長:280nm;柱溫:30℃。
2.2 提取方法
2.2.1 溶劑倍數(shù)的影響 取干燥的紫丁香葉粉碎,過120目篩,備用。取3份紫丁香葉細(xì)粉1g,精密稱定,置于圓底燒瓶中,分別加入50,100和200mL水,回流提取5h,濾過;用鹽酸調(diào)節(jié)濾液pH至2,用乙酸乙酯萃取3次,每次40mL,合并乙酸乙酯液;揮干溶劑,殘?jiān)蛹状歼m量溶解,轉(zhuǎn)移至10mL量瓶中,定容,濾過,取續(xù)濾液進(jìn)樣10μL分析。結(jié)果見表1。
2.2.2 提取時(shí)間的影響 取3份紫丁香葉細(xì)粉1g,精密稱定,置于圓底燒瓶中,加入100mL水,分別回流提取3,5和7h,濾過;用鹽酸調(diào)節(jié)濾液pH至2,用乙酸乙酯萃取3次,每次40mL,合并乙酸乙酯液;揮干溶劑,殘?jiān)蛹状歼m量溶解,轉(zhuǎn)移至10mL量瓶中,定容,濾過,取續(xù)濾液進(jìn)樣10μL分析。結(jié)果見表1。
2.2.3 回流次數(shù)的影響 取3份紫丁香葉細(xì)粉1g,精密稱定,置于圓底燒瓶中,加入100mL水,均回流提取5h,分別回流1次,2次(3h,2h),3次(2,2,1h)后,提取液濾過;鹽酸調(diào)節(jié)濾液pH至2,用乙酸乙酯萃取3次,每次40mL,合并乙酸乙酯液;揮干溶劑,殘?jiān)蛹状歼m量溶解,轉(zhuǎn)移至10mL量瓶中,定容,濾過,取續(xù)濾液進(jìn)樣10μL分析。結(jié)果見表1。
表1 不同提取因素對指標(biāo)成分含量的影響Tab.1 The influence of extraction factors on the component content
綜上所述,對紫丁香葉中原兒茶酸和原兒茶醛同時(shí)進(jìn)行提取,選擇水為溶劑,當(dāng)樣品量為1g、溶劑量為100mL、回流時(shí)間為5h、回流3次時(shí)(2h,2h,1h),提取率相對較高。
2.3 方法學(xué)考察
2.3.1 專屬性 在所選色譜條件下,樣品中原兒茶酸和原兒茶醛峰形和分離度良好,如圖1所示,該方法具有良好的專屬性。
2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 分別精密吸取5,7.5,10,12.5和15μL的原兒茶酸和原兒茶醛對照品混合溶液,進(jìn)樣,測定峰面積積分值,以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸,得到的線性回歸方程分別為:Y=28 294 X+12 322,r=0.999 7(線性范圍0.073~0.219μg);Y =22 294 X +3 694.4,r=0.999 6(線性范圍0.024 5~0.073 5μg)。
圖1 HPLC圖A.混合對照品;B.樣品;1.原兒茶酸;2.原兒茶醛Fig.1 HPLC chromatogramsA.mixed reference;B.sample;1.protocatechuic acid;2.protocatechualdehyde
2.3.3 精密度 原兒茶酸和原兒茶醛對照品溶液精密度:根據(jù)樣品所測的原兒茶酸的質(zhì)量濃度,精密量取原兒茶酸和原兒茶醛混合對照品儲(chǔ)備液5mL,稀釋到10mL作為原兒茶酸和原兒茶醛的混合對照品溶液,在相同條件下,連續(xù)進(jìn)樣6次,測得其精密度RSD為0.7%和0.8%。
樣品精密度:精密稱取柴丁香葉細(xì)粉1.0g,用100倍量的水回流提取3次(第1次2h,第2次2h,第3次1h)后,濾過,濾液濃縮至100mL,用鹽酸調(diào)節(jié)pH至2.0,用乙酸乙酯萃取3次,每次40mL,合并乙酸乙酯液,揮干,殘?jiān)蛹状既芙獠⒍ㄈ葜?0 mL的量瓶中,濾過。精密吸取續(xù)濾液10μL,重復(fù)進(jìn)樣6次,測定其峰面積。原兒茶酸和原兒茶醛的RSD分別為1.0%和2.4%。
2.3.4 重復(fù)性 取同一批紫丁香葉藥材約1.0g,精密稱定,共5份,按供試品溶液制備方法制備,并按上述色譜條件測定,原兒茶酸和原兒茶醛含量的RSD分別為1.8%和1.4%。
2.3.5 穩(wěn)定性 精密稱取紫丁香葉藥材1.0g,按供試品溶液制備方法制備,并在配制好的0,2,4,8,12,24和48h測定,結(jié)果表明樣品溶液在48h內(nèi)穩(wěn)定。
2.3.6 加樣回收率 取已知含量的樣品,研細(xì),精密稱取6份(每份約0.5g),分別置于索氏提取器中,再精密量取適量原兒茶醛及原兒茶酸對照品溶液(預(yù)先配制的與樣品中原兒茶醛及原兒茶酸含量相當(dāng)?shù)膶φ掌啡芤海?,分別加入樣品中,按供試品溶液制備方法制備,并按上述色譜條件測試,計(jì)算回收率。原兒茶醛回收率為98.6%,RSD為1.50%;原兒茶酸回收率為98.2%,RSD為0.889%(n=6)。
2.4 不同批次藥材含量測定 取干燥的紫丁香葉粉末約1g,精密稱定,按供試品處理方法處理,進(jìn)樣10μL分析,測得峰面積積分值,計(jì)算原兒茶酸和原兒茶醛含量,結(jié)果見表2。
表2 3批紫丁香葉藥材中有效成分含量測定結(jié)果Tab.2 Contents of protocatechuic acid and protocatechualdehyde in three batches of folium syringae (n=5)
在選擇提取溶劑時(shí),首先選擇了不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液按照同一種提取方式(超聲1h)對紫丁香葉中的原兒茶酸和原兒茶醛同時(shí)進(jìn)行提取,但含量較低,原因可能是提取溶劑或提取方式不合適?;亓魈崛『?,仍沒有獲得較好的提取效果,根據(jù)原兒茶酸和原兒茶醛的性質(zhì),其為酚酸類成分,具有水溶性,采用水為溶劑進(jìn)行提取。
溶劑量與提取效果緊密相關(guān),當(dāng)溶劑倍數(shù)為100倍時(shí),對紫丁香葉中的原兒茶酸和原兒茶醛基本完全提取。提取回流時(shí)間過長,導(dǎo)致原兒茶酸和原兒茶醛的含量下降,可能是原兒茶酸和原兒茶醛對熱不穩(wěn)定所致。
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