王佳麗，王 秀，夏 泉，3*，汪 楠，芮 盼

(1.安徽醫(yī)科大學藥學院，安徽合肥 230032;2.銅陵市人民醫(yī)院藥劑科，安徽銅陵 244000;3.安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院藥劑科國家中醫(yī)藥管理局中藥化學三級實驗室，安徽合肥 230022)

莪術為姜科植物蓬莪術Curcuma phaeocaulis Valeton、廣西莪術Curcuma kwangsinensis S.G.Lee et C.F.Liang和溫莪術Curcuma wenyujin Y.H.Chen et C.Ling的干燥根莖，具行氣破血、消積止痛的功效［1］。莪術的主要成分為揮發(fā)油［2］(莪術油，zedoary turmeric oil，ZTO)，是莪術經(jīng)過水蒸氣蒸餾得到的揮發(fā)油，具有抗腫瘤［3］、抗血栓［4］、抗菌抗病毒［5］等作用，為莪術發(fā)揮傳統(tǒng)功效的主要活性成分，莪術油主要含有莪術二酮、β-欖香烯、異莪術烯醇、莪術醇和吉馬酮［6］等。從已有的文獻報道來看，對從莪術油中分離單體的藥理作用研究主要集中在莪術醇和β-欖香烯的報道，如莪術醇誘導鼻咽癌CNE-2細胞的凋亡［7］，β-欖香烯乳對胃癌SGC-7901細胞生長具有較強的抑制作用［8］，對有關莪術二酮和吉馬酮藥理研究很少。研究表明，莪術油對多種腫瘤細胞的生長有抑制作用，包括胃癌SGC-7901細胞［9］、肺癌 A549細胞［10］等。莪術油中分離出的莪術二酮、莪術醇和吉馬酮是否對肝癌HepG2細胞有同樣的抑制增殖作用是本研究的主要內容。通過MTT法測定莪術油及其3種倍半萜化合物對HepG2細胞生長的抑制作用，以及流式細胞術監(jiān)測對細胞周期變化的影響，以期尋找莪術油中起抗腫瘤作用的活性成分。3種化合物的結構見圖1。

圖1 莪術油中3種倍半萜類化合物的結構

1 儀器與材料

1.1 藥品與試劑 莪術油購自浙江瑞安市制藥廠，莪術二酮、莪術醇、吉馬酮為作者單位藥學實驗室采用層析法分離并經(jīng)波譜分析鑒定 (純度99%)［11］。DMEM高糖培養(yǎng)基(賽默飛世爾生物化學制品公司)，胎牛血清 (四季青公司)，雙抗 (Beyotime公司)，MTT、PI、Rnase A、二甲基亞砜均為Sigma公司產品，5-FU(0.5 g/10 mL，天津金耀氨基酸有限公司，批號1212141)。

1.2 儀器 CO2培養(yǎng)箱 (美國Thermo Forma公司);multiskan mk3型酶標儀 (美國Thermo Forma公司);XDS-1B倒置顯微鏡 (寧波永新公司);SW-CJ-1D型凈化工作臺 (蘇州凈化);流式細胞儀 (Bechman coulter公司);Costar 96孔細胞培養(yǎng)板、25 mL細胞培養(yǎng)瓶 (美國 Corning公司)。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) HepG2細胞購自中科院上海細胞庫。細胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，添加終濃度為100 U/mL的青霉素及鏈霉素，37℃、5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)。對數(shù)生長期的細胞用于實驗。

2.2 用藥及分組 取對數(shù)生長期的HepG2細胞經(jīng)胰酶消化，配成4×104個/mL的細胞懸液實驗;莪術二酮和莪術醇分別配成終質量濃度為94.4、47.2、23.6、11.8、5.9 mg/L，吉馬酮配成終質量濃度為 87.4、43.7、21.8、10.9、5.45 mg/L，莪術油配成終質量濃度為944、472、236、118、59 mg/L。陰性對照組為0.05%無水乙醇稀釋液，陽性藥為12.5 mg/L的5-FU，每個質量濃度5個復孔，另設置一個正常對照組。

2.3 MTT法測定藥物對細胞增殖的影響 將HepG2細胞培養(yǎng)在96孔板，很據(jù)實驗分組用藥，每孔種4000個細胞，每孔100 μL細胞液，100 μL藥液。分別于加藥后24、48、72 h取出培養(yǎng)板，各加入含終質量濃度為0.5 mg/mL的MTT液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸出后每孔加入150 μL的二甲基亞砜，振蕩后，使結晶物充分溶解。在酶標儀上測定對照組及各用藥組在490 nm波長的吸收值。用吸收值的結果計算相對抑制率，抑制率=(對照組吸光度值－加藥組吸光度值)/對照組吸光度值×100%。

2.4 流式細胞術測定藥物對細胞周期的影響 細胞懸液1×106個/3 mL接種于25 mL的培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)24 h后每瓶加藥3 mL(莪術油118 mg/L，莪術二酮23.6 mg/L，吉馬酮21.8 mg/L，莪術醇47.2 mg/L)。藥物作用48 h后，胰酶消化后，離心8 min，1000 r/min，小心傾去懸液，加PBS洗2次，離心，1000 r/min，離心8 min，傾去洗液，緩慢加入4 mL的70%冰乙醇，－20℃放置12 h后，離心8 min，1200 r/min，傾去，加1 mL的0.5 μg/mL PI染液，流式細胞儀檢測細胞周期。

3 結果

3.1 MTT法測定藥物對細胞增殖的影響 MTT法測定結果顯示，莪術油、莪術二酮、莪術醇、吉馬酮對HepG2細胞增殖的影響具有劑量依賴性，且隨作用時間延長，抑制效果更加明顯結果見表1。

從圖2可以看出莪術二酮、莪術醇、吉馬酮和莪術油對細胞增殖的抑制作用隨時間延長而增強，72 h抑制作用最強，抑制作用呈質量濃度和時間依賴性。

3.2 流式細胞術測定藥物對細胞周期的影響 從表2和圖3中可以看出與正常組相比，莪術油、莪術二酮、莪術醇和吉馬酮能夠阻斷細胞的增殖，將細胞阻滯在G2期，其中莪術二酮、吉馬酮和莪術油組能顯著增加G2期的比例。

表1 莪術油及其3種倍半萜化合物對HepG2細胞增殖的影響 (，n=5)

表1 莪術油及其3種倍半萜化合物對HepG2細胞增殖的影響 (，n=5)

注:與正常組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

0.464±0.037 0.695±0.010 1.014±0.014莪術二酮組 5.9 0.454±0.035 0.682±0.010 0.965±0.077*11.8 0.434±0.029 0.650±0.016* 0.848±0.060＊＊23.6 0.386 ±0.054* 0.426 ±0.036＊＊ 0.516 ±0.043＊＊47.2 0.230 ±0.016＊＊ 0.179 ±0.020＊＊ 0.212 ±0.020＊＊94.4 0.126 ±0.004＊＊ 0.132 ±0.022＊＊ 0.138 ±0.048＊＊莪術醇組 5.9 0.457±0.035 0.663±0.005 0.994±0.07111.8 0.453±0.035 0.612±0.013* 0.901±0.059*23.6 0.451±0.035 0.590±0.033＊＊ 0.869±0.049*47.2 0.413 ±0.018 0.385 ±0.022＊＊ 0.388 ±0.030＊＊94.4 0.164 ±0.015＊＊ 0.169 ±0.020＊＊ 0.232 ±0.047＊＊吉馬酮組 5.45 0.453±0.034 0.573±0.019＊＊ 0.728±0.057＊＊10.9 0.445 ±0.036 0.541 ±0.007＊＊ 0.702 ±0.040＊＊21.8 0.373 ±0.026* 0.399 ±0.011＊＊ 0.530 ±0.035＊＊43.7 0.282 ±0.026＊＊ 0.287 ±0.016＊＊ 0.288 ±0.025＊＊87.4 0.117 ±0.032＊＊ 0.086 ±0.002＊＊ 0.094 ±0.016＊＊莪術油組 59 0.425±0.036 0.581±0.048＊＊ 0.679±0.056＊＊118 0.389 ±0.034* 0.426 ±0.020＊＊ 0.165 ±0.051＊＊236 0.132 ±0.014＊＊ 0.108 ±0.006＊＊ 0.123 ±0.031＊＊472 0.113 ±0.013＊＊ 0.106 ±0.010＊＊ 0.128 ±0.031＊＊944 0.111 ±0.013＊＊ 0.104 ±0.012＊＊ 0.119 ±0.029＊＊5-Fu 組 12.5 0.320±0.041＊＊ 0.252±0.038＊＊ 0.197±0.00624 h 48 h 72 h正常組組別 質量濃度/(mg·L－1) OD 值＊＊

圖2 HepG2細胞增殖抑制實驗結果

表2 莪術油及其3種倍半萜化合物對HepG2細胞周期的影響 (，n=3)%

表2 莪術油及其3種倍半萜化合物對HepG2細胞周期的影響 (，n=3)%

注:與正常組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

G0/G1 G2/M正常組組別 質量濃度/(mg·L－1) S期26.98±0.75 62.94±1.27 10.08±0.25莪術二酮組 47.2 25.48±1.09 59.98±0.40* 14.54±0.99＊＊莪術醇組 47.2 29.53±0.40* 59.40±0.98* 11.47±1.22*吉馬酮組 21.8 29.60±0.74* 56.02±1.38＊＊ 14.38±0.63＊＊莪術油組 59 30.86±0.22* 54.28±0.50＊＊ 14.86±0.28＊＊

圖3 流式細胞術監(jiān)測細胞周期結果

4 討論

4.1 目前對莪術油抗腫瘤藥理作用研究結果主要有直接細胞毒性、誘導腫瘤細胞凋亡［10］、影響癌細胞核酸代謝［12］、調控癌基因、抑癌基因及蛋白表達［13］、抑制腫瘤轉移侵襲及血管生成［14］等。有文獻報道，莪術油刺激細胞后A549細胞分泌的膠原隨劑量和作用的時間增加而減少，Cat D、Cat K蛋白的表達隨作用時間持續(xù)而增強［15］。對其中的莪術醇研究主要為在體外能抑制MCF7、MM231、HeLa、OVUL-2細胞的增殖，并能阻止 MCF7、MM231、HeLa細胞RNA的合成［16］。有關吉馬酮和莪術二酮的抗癌作用研究很少，僅報道吉馬酮能夠抑制乳腺癌細胞的增殖［17］。本實驗通過莪術油、莪術二酮、莪術醇和吉馬酮作用于HepG2細胞，進而觀察其對肝癌細胞的生長抑制作用。結果顯示3種單體對HepG2細胞都有抑制作用，吉馬酮相對抑制作用較強，莪術醇和莪術油對細胞的抑制作用與文獻報道［18］相一致，說明3種倍半萜類化合物可能是莪術油中起抗腫瘤活性成分。

4.2 有關細胞周期方面，流式細胞術檢測細胞周期結果表明莪術油、莪術二酮、莪術醇和吉馬酮能夠阻斷細胞的增殖，將細胞阻滯在G2期。有文獻報道莪術醇可使胃癌SGC-7901細胞周期阻滯在G0/G1期，S期細胞數(shù)減少，抑制細胞DNA復制和蛋白質的合成［19］。倍半萜類化合物能夠阻滯細胞周期的G2期的相關研究已有報道，如β-欖香烯能上調卵巢癌A2780細胞中p21、p27、p53蛋白的表達，使細胞周期阻滯于 G2期［20］，莪術醇能使A549細胞G2期比例升高［21］。在本實驗中莪術醇和吉馬酮能使得細胞周期在G0/G1-S期和S-G2/M期阻滯，莪術二酮僅表現(xiàn)為S-G2/M期阻滯，推測這3種物質均為倍半萜化合物，對細胞周期的抑制作用相似但又存在一些不同。而莪術油中含有多種倍半萜類物質，除以上3種外，還可能是其他倍半萜類成分起抑制作用，其作用機制有待進一步研究。

4.3 由于倍半萜類化合物的理化性質，MTT實驗中溶解時開始選用的是DMSO，結果其在保證溶解度的條件下對細胞有毒性，后來選用0.05%無水乙醇，實驗證明無水乙醇無細胞毒性，故選用其為溶劑。莪術油質量濃度的選擇根據(jù)莪術二酮的質量濃度計算，由于莪術二酮占莪術油的10%左右［11］，參考有關文獻［18］，故選用莪術二酮質量濃度的10倍作為莪術油的質量濃度。

4.4 流式細胞術檢測細胞周期時，細胞數(shù)不夠可能會導致分析結果可信度不高。為增大細胞數(shù)，盡量減少處理過程中的流失，加藥質量濃度的選擇依照MTT結果，3種倍半萜取48 h抑制率在50%左右的質量濃度，莪術油改用59 mg/L。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2010年版一部［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:257-258.

［2］張清哲，楊 芳，朱晶晶，等.GC-MS比較溫郁金、溫莪術、片姜黃中揮發(fā)油的化學組成［J］.中國中藥雜志，2010，35(19):2590-2593.

［3］宋愛莉，殷玉琨.莪術油干預治療腫瘤的研究及應用概況［J］.山東中醫(yī)藥大學學報，2008，32(2):172-174.

［4］陳家源，鐘正賢，盧文杰，等.抗血栓藥材醇提取物的篩選研究［J］.廣西醫(yī)藥，2009，31(8):1067-1069.

［5］徐建私，孫愛華.莪術油滴眼液體內外抗菌和抗病毒作用的藥效學研究［J］.微生物學雜志，2008，28(2):77-81.

［6］Zhu J J，An Y W，Hu G，et al.Simultaneous determination of multiple sesquiterpenes in Curcuma wenyujin herbal medicines and related products with one single reference standard［J］.Molecules，2013，18(2):2110-2121.

［7］劉健翔，王 娟，蔣曉山，等.莪術醇誘導鼻咽癌CNE-2細胞凋亡作用及其抗腫瘤機制探討［J］.時珍國醫(yī)國藥，2012，23(6):1339-1341.

［8］朱 行，李 華.欖香烯乳對胃癌SGC-7901細胞株端粒酶活性及細胞凋亡的影響［J］.復旦學報:醫(yī)學版，2001，1(4):5-8.

［9］孫宏巖，邵淑麗，李 爽，等.莪術油對胃癌細胞SGC-7901增殖和凋亡的影響［J］.齊齊哈爾大學學報，2012，28(4):33-37.

［10］王曉波，牛建昭，崔 巍，等.莪術油對人肺腺癌細胞A549增殖的影響［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2011，18(9):41-43.

［11］夏 泉，劉金旗，彭代銀.莪術油中莪術二酮的分離和鑒定［J］.中成藥，2008，30(8):1185-1188.

［12］許振國，宋愛莉，殷玉琨，等.莪術油對大鼠乳腺癌癌前病變組織VEGF mRNA表達的影響［J］.中華腫瘤防治雜志，2012，19(8):570-574.

［13］楊麗華，姜 杰.莪術油對人乳腺癌MCF-7細胞凋亡及Bcl-2、Bax表達的影響［J］.浙江中西醫(yī)結合雜志，2010，20(12):741-743.

［14］劉曉菲，宋愛莉，李靜蔚.莪術油對大鼠乳腺癌癌前病變MVD及相關調控因子VEGF/FLK表達的干預作用研究［J］.中醫(yī)藥學報，2011，39(4):19-21.

［15］楊長福，黃春芳，孫曉芳，等.莪術油對人肺腺癌A549細胞中組織蛋白酶D，K表達的影響［J］.中國中藥雜志，2012，37(6):84284-84286.

［16］徐立春，邊可君，劉志敏，等.天然藥物莪術醇抑制腫瘤細胞生長及RNA合成影響的初步研究［J］.腫瘤，2005，25(6):570-572.

［17］Zhong Z，Chen X，Tan W，et al.Germacrone inhibits the proliferation of breast cancer cell lines by inducing cell cycle arrest and promoting apoptosis［J］.Eur J Pharmacol，2011，667(1-3):50-55.

［18］唐 淵，李曉輝.莪術油提取物對肝癌細胞系HepG2的抗癌作用及機制研究［J］.中國藥理學通報，2007，23(6):790-794.

［19］楊甲平，齊寶寧.莪術醇對人胃癌SGC-7901細胞增殖和凋亡的影響［J］.陜西中醫(yī)學院學報，2009，32(6):69-71.

［20］Li X，Wang G，Zhao J，et al.Antiproliferative effect of β-elemene in chemoresistant ovarian carcinoma cells is mediated through arrest of the cell cycle at the G2-M phase［J］.Cell Mol Life Sci，2005，62(7/8):894 –904.

［21］楊長福，牛建昭，王繼峰，等.莪術醇通過降解ECM改變細胞周期抑制 A549細胞增殖［J］.遼寧中醫(yī)雜志，2011，38(5):824-826.