張科衛(wèi)，馬彩霞，繆六舒

(南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇南京 210023)

干姜為姜科植物姜 Zingiber Offtcinale Rosc.的干燥根莖，味辛，性熱，歸脾、胃、腎、心、肺經(jīng)。具有溫中散寒，回陽通脈，溫肺化飲之功。用于腕腹冷痛，嘔吐泄瀉，肢冷脈微，寒飲喘咳等癥。

炮姜是干姜經(jīng)砂燙法制得的炮制加工品，味辛，性熱，歸脾、胃、腎經(jīng)。具有溫經(jīng)止血，溫中止痛之功。用于陽虛失血，吐衄崩漏，脾胃虛寒，腹痛吐瀉等癥［1］。

干姜、炮姜均為生姜的加工炮制品，而兩者主治功效差異甚大，這必與其炮制前后的成分改變有很大關(guān)系。查閱文獻(xiàn)，目前對干姜、炮姜中總的成分的比較研究鮮見報(bào)道。

多糖類物質(zhì)在中藥中廣泛存在，具有降血糖、降血脂、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗腫瘤等多種生物活性［2-7］。有研究表明，生姜中所含的多糖類物質(zhì)有很好的抗氧化活性［8］。

姜酚類物質(zhì)是目前生姜中發(fā)現(xiàn)的另一大類有效物質(zhì)。藥理學(xué)方面的實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，姜酚類物質(zhì)具有抗氧化［9］、抗腫瘤［10］、抗神經(jīng)損傷和細(xì)胞保護(hù)［11］、抗嘔吐［12］等多種生理活性。

近年來的研究還表明，生姜中富含黃酮類成分，且該類成分具有抗氧化［13-15］、抑菌［16］等生理活性。

干姜、炮姜為生姜的炮制加工品，生姜經(jīng)過一定的炮制，其中的多糖、總酚、黃酮類物質(zhì)是否發(fā)生了改變，目前尚未見到相關(guān)文獻(xiàn)的報(bào)道。

對干姜、炮姜中幾種姜酚類成分的測定雖有相關(guān)報(bào)道，但是所取樣本地域范圍較小，不足以體現(xiàn)我國幅員遼闊，及生姜出口大國的地位。

本實(shí)驗(yàn)對來自全國多個產(chǎn)地的干姜、炮姜中所含的多糖類、總酚類、總黃酮類成分及幾種姜酚類物質(zhì)進(jìn)行了定量測定及比較研究，以期為進(jìn)一步研究生姜的炮制機(jī)理進(jìn)行一定的探索。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津UV-2401紫外可見分光光度計(jì);Sartorius BP211D型電子天平;TCG-16G臺式離心機(jī) (上海安亭科學(xué)儀器廠)。Waters e2695型高效液相色譜儀，2998PDA檢測器，Millennium32色譜管理系統(tǒng);Sartorius BP211D型電子天平。

1.2 試藥 葡萄糖 (批號110833200503)、沒食子酸 (批號110831-200803);蘆丁 (批號080-9303)對照品均購自中國藥品生物制品檢定所(供含量測定用);6-gingerol(批號111228)、8-gingerol(批號120302)、10-gingerol(批號120316)、6-shogaol(批號110516)對照品均購自四川維克奇生物科技有限公司，經(jīng)HPLC檢測為單一成分，純度達(dá)到98%以上。

乙腈、甲醇為色譜純;水為亞沸蒸餾水 (自制);其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

生姜藥材產(chǎn)地分別為海南?？?、湖北武漢、山東滕州、山東郯城、福建永春、湖南永州、江西上饒、安徽澮溝、四川西昌、江蘇鄒莊。以上生姜均為2012年3月收集得到。

1.3 干姜的制備 取上述各產(chǎn)地的生姜，洗凈，切片，50℃ 干燥;打粉，過4號篩，即得。

1.4 炮姜的制備 將上述各產(chǎn)地的生姜 (與制備干姜的生姜為同一批次)，洗凈，切片，50℃ 干燥，得干姜飲片;將此干姜飲片按砂燙法燙至鼓起，表面棕褐色時，取出，放涼;打粉，過4號篩，即得。

2 方法與結(jié)果

2.1 多糖測定 參照本課題組百合多糖測定方法［17］，結(jié)果見表 1。

2.2 總酚測定 參照本課題組生姜中總酚測定的方法［18］，結(jié)果見表 2。

表1 不同產(chǎn)地干姜、炮姜中所含多糖的量 (n=6)Tab.1 Contents of polysaccharide in dried ginger(ganjiang)and processed ginger(paojiang)from different habitats(n=6)

表2 不同產(chǎn)地的干姜、炮姜中所含總酚的量 (n=6)Tab.2 Contents of total phenols in dried ginger(ganjiang)and processed ginger(paojiang)from different habitats(n=6)

2.3 黃酮測定

2.3.1 試劑的配制

2.3.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取干燥至恒重的蘆丁對照品適量，加60%乙醇，配制成0.2090 mg/mL的對照品貯備液。

2.3.1.2 干姜供試品溶液的制備 精密稱取干姜細(xì)粉1.0 g，加60% 乙醇20 mL，超聲 (工作頻率80 kHz，功率 250 W)30 min，離心 (4900 r/min)5 min，取上清液置50 mL量瓶中，殘?jiān)?0% 乙醇洗滌2次，每次5 mL，同前離心，合并上清液，加60% 乙醇定容，搖勻。

2.3.1.3 炮姜供試品溶液的制備 精密稱取炮姜細(xì)粉1.0 g，同“干姜供試品溶液的制備”項(xiàng)下操作。即得。

2.3.2 測定波長的選擇 精密吸取對照品溶液、干姜供試品溶液、炮姜供試品溶液各0.5、0.5、0.2 mL，分別置于10 mL的棕色具塞試管中，分別加入60% 乙醇0.5、0.5、0.8 mL，搖勻，分別依次加入甲醇1 mL，10%AlCl3溶液0.1 mL和0.1 mL醋酸鉀溶液，蒸餾水2.8 mL，60% 乙醇5.0 mL，搖勻，室溫放置 30 min，于 200～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果表明，對照品溶液和供試品溶液的最大吸收波長均為270 nm(見圖1)。

圖1 對照品 (蘆丁)及樣品 (江蘇鄒莊干姜黃酮、江蘇鄒莊炮姜黃酮)的紫外光譜圖Fig.1 UV Spectrum of reference substance(rutin)and samples(general flavones in dried ginger(ganjiang)and processed ginger(paojiang)from Zouzhuang of Jiangsu province)

2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取對照品貯備液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL置于10 mL具塞試管中，分別加 60% 乙醇 1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0.0 mL，加入 1.0 mL甲醇，10%AlCl3溶液0.1 mL和0.1 mL醋酸鉀溶液，蒸餾水2.8 mL，60% 乙醇 5.0 mL，搖勻，室溫放置 30 min，在270 nm測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程為Y=0.0398X-0.0203，r=0.9999。線性范圍為4.18 ～20.90 μg/mL。

2.3.4 精密度試驗(yàn) 取0.01254 mg/mL的對照品溶液，重復(fù)測定6次，記錄其吸光度的值，RSD為0.45%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.3.5.1 干姜黃酮穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取新鮮配制的干姜供試品 (江蘇鄒莊產(chǎn))溶液0.5 mL置于10 mL的棕色具塞試管中，照“2.3.2”項(xiàng)下操作，分別于0、0.5、1、1.5、2 h測定其在270 nm處的吸光度，結(jié)果RSD為0.76%，結(jié)果表明本法所測樣品在2 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.3.5.2 炮姜黃酮穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取新鮮配制的炮姜供試品 (江蘇鄒莊產(chǎn))溶液0.2 mL，加60% 乙醇0.8 mL，置于10 mL的棕色具塞試管中，照“2.3.2”項(xiàng)下操作，分別于 0、0.5、1、1.5、2 h測定其在270 nm處的吸光度，結(jié)果RSD為0.88%。表明本法所測的干姜、炮姜樣品溶液在2 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.3.6 重復(fù)性試驗(yàn) 分別精密稱取產(chǎn)自江蘇鄒莊并經(jīng)低溫干燥至恒重的干姜、炮姜細(xì)粉約1.0 g，平行6份。分別制成供試品溶液，照“2.3.2”項(xiàng)下操作，結(jié)果其中干姜所含黃酮的平均含有量為1.09%，RSD為0.99%;炮姜所含黃酮的平均含有量為2.71%，RSD為1.20%。表明所測樣品的重復(fù)性良好。

2.3.7 加樣回收率試驗(yàn)

2.3.7.1 干姜加樣回收率試驗(yàn) 取蘆丁對照品適量，加60%乙醇溶解，配成質(zhì)量濃度為0.5642 mg/mL的溶液，作為加樣對照品貯備液。取產(chǎn)自江蘇鄒莊并經(jīng)低溫干燥至恒重的干姜細(xì)粉，精密稱取該細(xì)粉約0.5 g，平行6份，精密加入加樣對照品貯備液 10.0 mL，加 60% 乙醇 10 mL，照“2.3.1.2”及“2.3.2”項(xiàng)下操作，于 270 nm處測定吸光度的值并計(jì)算回收率，得平均回收率為100.02%，RSD為1.57%。

2.3.7.2 炮姜加樣回收率試驗(yàn) 取蘆丁對照品適量，加 60% 乙醇溶解，配成質(zhì)量濃度為1.3645 mg/mL的溶液，作為加樣對照品貯備液。取產(chǎn)自江蘇鄒莊并經(jīng)低溫干燥至恒重的炮姜細(xì)粉，精密稱取該細(xì)粉約0.5 g，平行6份，精密加入加樣對照品貯備液 10.0 mL，加 60% 乙醇 10 mL，照“2.3.1.2”及“2.3.2”項(xiàng)下操作，于270 nm處測定吸光度的值并計(jì)算回收率，得平均回收率為99.46%，RSD為1.02%。

2.3.8 樣品測定 取各產(chǎn)地的干姜、炮姜細(xì)粉，各精密稱取約1.0 g，每個產(chǎn)地平行3份，按供試品溶液制備方法制備，照“2.3.2”項(xiàng)下操作，測定其270 nm處的吸光度，每份平行測定2次。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其中黃酮的量。結(jié)果見表3。

表3 不同產(chǎn)地的干姜、炮姜中所含黃酮的量 (n=6)Tab.3 Contents of general flavones in dried ginger(ganjiang)and processed ginger(paojiang)from different habitats(n=6)

2.4 幾種活性成分的測定

2.4.1 色譜條件 Agilent TC-C18(2)(4.6 mm×250 mm，5 μm);流動相為乙腈 (A)-水 (B)，梯度洗脫 (0～15 min，15% ～50%A;15～45 min，50%A;45～65 min，50% ～80%A;65～67 min，80% ～100% A;67 ～69min，100%～15%A;再保持13 min至82 min);體積流量1.0 mL/min;柱溫30℃;檢測波長280 nm。理論塔板數(shù)以6-gingero計(jì)不低于4000，并且6-gingerol、8-gingerol、10-gingerol、6-shogaol 與其他相鄰組分的分離度均大于1.5。見圖2。

2.4.2 溶液的制備

2.4.2.1 對照品溶液的制備 取減壓干燥至恒重的 6-gingerol、8-gingerol、10-gingerol、6-shogaol 適量，精密稱定，配制含6-gingerol 3002 μg/mL、8-gingerol 376 μg/mL、6-shogaol 74 μg/mL、10-gingerol 452 μg/mL的混合對照品溶液，作為混合對照品貯備液。

2.4.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取各產(chǎn)地干姜、炮姜各1.0 g，加30 mL甲醇，超聲 (工作頻率80 kHz，功率250 W)30 min，4900 r/min離心10 min，取上清液置50 mL量瓶中，殘?jiān)蛹状枷礈靸纱?，每? mL，同前離心，合并上清液，加甲醇定容，搖勻。即得。

2.4.3 線性關(guān)系的考察 精密稱取該貯備液0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mL置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解定容至刻度，搖勻，制得混合對照品溶液系列Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ。取 10 μL進(jìn)樣，測定，以對照品質(zhì)量濃度對峰面積平均值作圖，結(jié)果經(jīng)回歸分析，6-gingerol在30.02～480.32 μg/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=5582.2X－39667，r= 0.999 9;8-gingerol在 3.76 ～60.16 μg/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，回歸方程為 Y=5764.4X－1452.8，r=0.9999;6-shogaol在0.74～11.84 μg/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，回歸方程為 Y=14856X+1590.4，r=0.9998;10-gingerol在4.52～72.32 μg/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，回歸方程為 Y=5837.7X－7859.6，r=0.9998。

2.4.4 精密度試驗(yàn)

2.4.4.1 對照品精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對照品溶液Ⅲ10 μL進(jìn)樣，重復(fù)6次，以峰面積計(jì)算RSD，結(jié) 果 6-gingerol、8-gingerol、6-shogaol、10-gingerol的RSD分別為1.83%、1.19%、1.55%、0.53%。

2.4.4.2 干姜精密度試驗(yàn) 取干姜供試品溶液(海南?？?重復(fù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣量10 μL，記錄所測各組分積分面積。結(jié)果6-gingerol、8-gingerol、6-shogaol、10-gingerol的 RSD分別為 1.71%、1.40%、1.67%、1.86%。

圖2 對照品及樣品的HPLC圖譜Fig.2 HPLC chromatogroms of reference substance and samples

2.4.4.3 炮姜精密度試驗(yàn) 取炮姜供試品溶液(海南海口)重復(fù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣量10 μL，記錄所測各組分積分面積。結(jié)果6-gingerol、8-gingerol、6-shogaol、10-gingerol的 RSD分別為 0.89%、0.50%、0.87%、1.09%。

控制預(yù)測[6]系統(tǒng)是超導(dǎo)磁場儲能型微網(wǎng)預(yù)測控制模型的核心部分,并且是最復(fù)雜與關(guān)鍵的板塊,能夠劃分為兩個板塊:外環(huán)控制和內(nèi)環(huán)控制。

2.4.5 重復(fù)性試驗(yàn)

2.4.5.1 干姜 取同一批次海南海口干姜，按供試品溶液的制備方法平行制備6份，依法測定，計(jì)算各組分的量，結(jié)果 6-gingerol、8-gingerol、6-shogaol、10-gingerol的 RSD分別為0.82%、1.41%、0.92%、1.96%。

2.4.5.2 炮姜 取同一批次海南?？谂诮?，按供試品溶液的制備方法平行制備6份，依法測定，計(jì)算各組分的量，結(jié)果 6-gingerol、8-gingerol、6-shogaol、10-gingerol的 RSD分別為1.88%、1.07%、1.76%、1.85%。

2.4.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.4.6.1 干姜 新配制的干姜供試品溶液 (海南?？诋a(chǎn))，分別于 0、1.5、3.0、4.5、6.0、7.5、9.0、10.5、12 h進(jìn)樣 9次，測定 6-gingerol、8-gingerol、6-shogaol、10-gingerol峰面積，結(jié)果其RSD分別為 1.81%、1.09%、1.56%、1.53%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.6.2 炮姜 新配制的炮姜供試品溶液 (海南海口產(chǎn))，分別于 0、1.5、3.0、4.5、6.0、7.5、9.0、10.5、12 h進(jìn)樣 9次，測定 6-gingerol、8-gingerol、6-shogaol、10-gingerol峰面積，結(jié)果其RSD分別為 1.46%、1.49%、1.73%、1.79%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.7 加樣回收率試驗(yàn)

2.4.7.1 干姜 分別精密稱取6-gingerol、8-gingerol、6-shogaol、10-gingerol各適量，配制成含 6-gingerol 673.12 μg/mL、8-gingerol 99.92 μg/mL、6-shogaol 5.06 μg/mL、10-gingerol 179.96 μg/mL的混合溶液，即為加樣對照品貯備液。

精密稱取干姜 (海南?？诋a(chǎn))0.5 g，平行6份，精密加入上述加樣對照品貯備液5.0 mL，照供試品溶液制備項(xiàng)下操作。結(jié)果，6-gingerol、8-gingerol、6-shogaol、10-gingerol的加樣回收率分別為 99.93%、99.69%、99.78%、99.87%，RSD分別為1.55%、1.61%、1.27%、1.74%。

2.4.7.2 炮姜 分別精密稱取6-gingerol、8-gingerol、6-shogaol、10-gingerol各適量，配制成含 6-gingerol 419.6 μg/mL、8-gingerol 70.4 μg/mL、6-shogaol 55.6 μg/mL、10-gingerol 145.6 μg/mL 的混合溶液，即為加樣對照品貯備液。

精密稱取炮姜 (海南?？诋a(chǎn))0.5 g，平行6份，精密加入上述加樣對照品貯備液5.0 mL，照供試品溶液制備項(xiàng)下操作。結(jié)果，6-gingerol、8-gingerol、6-shogaol、10-gingerol的加樣回收率分別為 99.81%、99.03%、99.27%、99.45%，RSD分別為1.56%、1.33%、1.56%、1.54%。

2.4.8 樣品測定 取各產(chǎn)地的干姜、炮姜，照“2.4.2.2”項(xiàng)下操作，制成供試品溶液，取10 μL進(jìn)樣，以外標(biāo)法計(jì)算，每個產(chǎn)區(qū)的干姜、炮姜平行3份，每份進(jìn)樣2次。結(jié)果見表4。

3 結(jié)論與討論

3.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，來自全國各產(chǎn)地的干姜與炮姜中多糖、總酚、黃酮及幾種活性成分的量差異顯著，同批次生姜炮制品中，炮姜中所含有的多糖、總酚、黃酮的量明顯高于干姜;而對幾種活性成分的量測定結(jié)果表明，炮姜中所含的6-gingerol、8-gingerol、10-gingerol的量明顯低于干姜，而 6-shogaol的量明顯高于干姜，這可能與在砂炒過程中，由于受高溫的影響，飲片中的相關(guān)成分發(fā)生了變化有關(guān)。

表4 不同產(chǎn)地的干姜、炮姜中幾種姜酚類成分的量 (n=6)Tab.4 Contents of several gingerols and 6-shogaol in dried ginger(ganjiang)and processed ginger(paojiang)from different habitats(n=6)

3.2 干姜中含多糖量最高的為福建永春，13.99%;含多糖量最低的為山東滕州，3.23%。十個產(chǎn)地的干姜中多糖平均含有量為7.01%。炮姜中含多糖量最高的為海南?？冢?7.88%;含多糖量最低的為山東郯城，7.87%。十個產(chǎn)地的炮姜中多糖平均含量為11.90%。

3.3 在實(shí)驗(yàn)過程中，本課題組還測定了干姜和炮姜中的總糖量、非多糖量，結(jié)果表明，干姜和炮姜中所含有的總糖量基本一致，非多糖量與多糖量呈現(xiàn)明顯的負(fù)相關(guān)。說明在炮制過程中，由于受高溫的影響，多糖量升高，非多糖量下降。至于在炮制過程中，這些多糖和非多糖的結(jié)構(gòu)到底如何改變，以及這些改變是否與干姜、炮姜的功效有直接的關(guān)系，值得進(jìn)一步深入研究。

3.4 干姜中含總酚量最高的為安徽澮溝，1.85%，含總酚量最低的為海南?？?，1.23%，十個產(chǎn)地的干姜中總酚平均含有量為1.53%。炮姜中含總酚量最高的為湖北武漢，2.86%，最低為福建永春，1.68%。十個產(chǎn)地的炮姜中含總酚的平均含有量為2.09%。

3.5 干姜中含黃酮量最高的為江西上饒，1.32%，含黃酮量最低的為海南?？冢?.94%，十個產(chǎn)地的干姜中黃酮平均含量為1.12%。炮姜中含黃酮量最高的為山東郯城，4.14%，含黃酮量最低的為福建永春，1.86%，十個產(chǎn)地的炮姜中黃酮的平均含量為2.86%。

3.6 在《中國藥典》2010年版中，干姜和炮姜的含量測定項(xiàng)下僅測定了6-姜辣素 (即6-gingerol)，這個方法對控制其質(zhì)量不是很全面，也不科學(xué)。本實(shí)驗(yàn)對其中的多種姜酚類成分進(jìn)行了測定，同時還對其中的多糖、總酚、黃酮類物質(zhì)也進(jìn)行了定量測定研究。以期為控制干姜和炮姜的質(zhì)量做一些有益的探索。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2010年版一部［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:13-15.

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