朱 倩，付文煥，李近磊，張惠清，李中東

(復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院，上海 200040)

復(fù)方芙蓉葉糊 (曾用名:三圣散)為復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院特色外用制劑，由芙蓉葉、赤小豆組方而成，功能主治解毒排膿，用于消炎消腫［1-2］。臨床應(yīng)用30余年，效果良好。該制劑主要原料為中藥材原粉，且輔料為麥芽糖，制備成糊劑后很難再對(duì)其進(jìn)行常規(guī)滅菌，細(xì)菌數(shù)、霉菌酵母菌數(shù)均難以控制，成品制劑的微生物限度檢驗(yàn)結(jié)果很難達(dá)到《中國(guó)藥典》2010年版要求。因此考慮在制劑制備前，對(duì)原料中的中藥原粉進(jìn)行滅菌處理后再制成制劑，嚴(yán)格控制制劑制備環(huán)境，以使成品制劑達(dá)到微生物限度要求。芙蓉葉粉為本制劑主要原料，且為制劑的主要藥用成分。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)芙蓉葉粉進(jìn)行熱壓滅菌、60鈷輻射滅菌和低溫間歇滅菌，考察原料滅菌后的性狀、主要成分含有量及滅菌效果，確定該原料的最佳滅菌工藝。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters 2695高效液相色譜儀，Dikama C18柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);Sartorius BL150 電子天平，YXQ-LS-50S II型立式壓力蒸汽滅菌器;DHG-9426電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，60鈷射線源由中國(guó)科學(xué)院上海輻照中心提供。

1.2 試藥 芙蓉葉粉 (上海市虹橋飲片廠);蘆丁對(duì)照品(批號(hào)100080-200707，中國(guó)藥品生物制品檢定所);槲皮素對(duì)照品 (批號(hào)100081-200406，中國(guó)食品藥品檢定研究院)。

1.3 培養(yǎng)基 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 (批號(hào)20101218)、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基 (批號(hào)20101121)、蛋白胨水培養(yǎng)基 (批號(hào)20101130)、膽鹽乳糖培養(yǎng)基 (批號(hào)20101207)、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基 (批號(hào)20101211)、甘露醇氯化鈉瓊脂平板(20101208)、溴化十六烷基三甲銨瓊脂平板 (批號(hào)20101208)，均購(gòu)自上海盛思生化科技有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 滅菌方法

2.1.1 熱壓滅菌法［3］將20 g芙蓉葉粉稱入干燥滅菌試管中，密封。置壓力蒸汽滅菌器中，121℃下，滅菌30 min。

2.1.260鈷輻射滅菌法［4-5］將20 g芙蓉葉粉稱入干燥滅菌試管中，密封。在中國(guó)科學(xué)院上海輻照中心進(jìn)行60鈷輻射滅菌，輻照強(qiáng)度6 kGy。

2.1.3 低溫間歇滅菌法［6-7］將5 g芙蓉葉粉稱入直徑90 mm有蓋滅菌培養(yǎng)皿中，置電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中，60℃恒溫1 h后，于25℃保持24 h，記為滅菌1次;同法在60℃下分別滅菌2次、3次和4次。依上述方法同法操作，于70℃與80℃下分別各滅菌2次、3次、4次。

2.2 微生物限度檢查［8-9］對(duì)原粉及上述3種方法滅菌后的樣品，按《中國(guó)藥典》微生物限度檢查法，進(jìn)行微生物限度檢查。按芙蓉葉原料占原制劑處方百分比16%，換算細(xì)菌數(shù)與霉菌數(shù)。滅菌前后原料性狀及微生物限度檢查結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 芙蓉葉粉不同滅菌方法微生物限度檢查結(jié)果 (n=3)

2.3 定量測(cè)定［10-12］

2.3.1 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取對(duì)照品適量，用60%乙醇溶解后配制成含蘆丁105.6 μg/mL、槲皮素105.4 μg/mL的對(duì)照品溶液。

2.3.2 供試品溶液的制備 精密稱取芙蓉葉粉末 (過(guò)80目篩)2 g，于100 mL錐形瓶中，加入60 mL 60%乙醇溶液，稱定質(zhì)量，超聲提取3 h，冷卻后用60%乙醇溶液補(bǔ)足質(zhì)量。經(jīng)0.45 μm的濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液供 HPLC測(cè)定用。

2.3.3 色譜條件 Dikama C18色譜柱 (4.6 mm ×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸水溶液洗脫 (45∶55)，體積流量1 mL/min，柱溫35℃，檢測(cè)波長(zhǎng)350 nm。在該色譜條件下，蘆丁、槲皮素分離良好。色譜圖見(jiàn)圖1～2。

圖1 蘆丁、槲皮素對(duì)照品HPLC圖譜

圖2 芙蓉葉粉供試品HPLC色譜圖

2.3.4 線性關(guān)系考察 分別精密量取對(duì)照品溶液2、5、10、15、20 μL。依照上述色譜條件測(cè)定蘆丁及槲皮素峰面積，以峰面積為Y，進(jìn)樣量為X，進(jìn)行線性回歸分析，得蘆丁、槲皮素的回歸方程分別為:Y蘆丁=1468327X+24468，r=0.9994;Y槲皮素=2992329X － 123978，r=0.9993。結(jié)果表明，蘆丁、槲皮素分別在0.2112～2.112 μg、0.2108～2.108 μg間呈良好的線性關(guān)系。

2.3.5 精密度試驗(yàn) 對(duì)同一份芙蓉葉樣品平行測(cè)定5次，蘆丁、槲皮素的RSD分別為2.3%、3.5%(n=5)。

2.3.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱同一份芙蓉葉樣品5份，按上述方法制備供試品溶液，參照上述色譜條件，分別測(cè)定蘆丁、槲皮素的重復(fù)性RSD分別為4.26%、3.66%(n=5)。

2.3.7 回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含有量的芙蓉葉藥材粉末9份，每份2 g，按樣品含蘆丁、槲皮素的50%精密加入蘆丁、槲皮素對(duì)照品溶液，按相同方法制備供試品溶液，進(jìn)樣量10 μL。結(jié)果蘆丁、槲皮素的回收率分別為97% ～104%，93%～98%;精密度 (RSD)分別為1.7%～2.0%、1.5% ～2.7%(n=3)。

2.3.8 供試品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別在0、4、8、12、24 h測(cè)定蘆丁、槲皮素，其RSD分別為2.1%、4.2%(n=5)，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.9 樣品的測(cè)定 分別取不同滅菌工藝處理后的芙蓉葉藥材粉末，參照上述方法制備供試品溶液、按相同的色譜條件進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同滅菌方法對(duì)芙蓉葉粉中蘆丁及槲皮素的影響 (n=3)

3 討論

3.1 微生物檢查及定量測(cè)定結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)3種方法滅菌后，芙蓉葉藥材能夠符合藥典微生物限度標(biāo)準(zhǔn)的為熱壓滅菌法、60鈷輻射滅菌法及低溫間歇滅菌法80℃下4次滅菌。對(duì)這3種滅菌后的芙蓉葉粉中蘆丁槲皮素進(jìn)行測(cè)定，表2結(jié)果顯示，芙蓉葉主要的黃酮類成分在低溫間歇滅菌法前后差異不大;熱壓滅菌法及60鈷輻射滅菌法對(duì)芙蓉葉中蘆丁及槲皮素的含有量有影響。

3.2 本研究中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)熱壓滅菌后，芙蓉葉粉的性狀有明顯改變，粉末顏色發(fā)生變化，且有結(jié)塊現(xiàn)象，并且在放置冷卻過(guò)程中粉末容易吸潮不利于下一步的制劑生產(chǎn)，故該藥材粉末不適用于熱壓滅菌法。

3.3 上述試驗(yàn)結(jié)果表明，通過(guò)60鈷輻射滅菌，芙蓉葉粉中主要成分含有量發(fā)生變化。使用經(jīng)60鈷輻射滅菌的芙蓉葉粉制備芙蓉葉糊劑的過(guò)程中，在原處方比例條件下難以成形。輻照滅菌技術(shù)與傳統(tǒng)的蒸汽壓力消毒滅菌、化學(xué)及過(guò)濾滅菌法相比，輻照滅菌法可在常溫下消毒滅菌而不破壞易揮發(fā)成分及熱敏性物質(zhì)，穿透力強(qiáng)，消毒均勻快速，操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，但是對(duì)芙蓉葉進(jìn)行輻照滅菌，會(huì)破壞其成分［13-14］。這提示我們?cè)谶x擇輻射滅菌法對(duì)中藥材進(jìn)行處理時(shí)需要注意進(jìn)行充分考察驗(yàn)證。

綜上所述，低溫間歇滅菌法可作為芙蓉葉粉控制微生物限度的滅菌方法。該方法操作不需要特殊設(shè)備，操作簡(jiǎn)便、安全、快捷，藥品質(zhì)量穩(wěn)定，成本低，可用于復(fù)方芙蓉葉糊中芙蓉葉粉藥材的滅菌。同時(shí)本研究為一些不耐高溫高壓、濕熱的中藥原料滅菌提供了參考。

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