李勇，杜娟，余靜，王海燕，岳彩黎，曾靈，蔣建新

肺泡上皮(alveolar epithelium)由兩種細(xì)胞組成，即Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞(alveolar type Ⅰ cell，ATI)和Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞(alveolar type Ⅱ cell，ATⅡ)。傳統(tǒng)的觀點(diǎn)認(rèn)為ATⅡ是肺泡上皮中具有生物學(xué)活性的細(xì)胞，而終末分化的ATI只是被動(dòng)地參與氣血屏障的形成，不增殖，也不具有可塑性[1]。但最近的研究發(fā)現(xiàn)ATI可能不只是傳統(tǒng)意義上的終末分化細(xì)胞，而具有多樣的生物學(xué)功能，并在損傷修復(fù)過程中發(fā)揮一定作用[2]。雖然ATI數(shù)量只占全肺總細(xì)胞數(shù)的8%，但卻覆蓋了95%～98%的肺泡表面積[3]。ATI參與氣血屏障的形成，對(duì)于正常的換氣功能非常重要。由于ATI易破裂，缺少生物學(xué)標(biāo)記，分離相對(duì)困難，因此目前針對(duì)ATI的研究主要采用由ATⅡ分化而來的ATI樣細(xì)胞，但其生物學(xué)特性與ATI細(xì)胞存在一定差異[4]。T1α是一種跨膜蛋白，研究表明其在肺臟中特異性表達(dá)于ATI細(xì)胞[5]，已廣泛應(yīng)用于ATI細(xì)胞的分離與鑒定[6-9]。本研究的目的是改良細(xì)胞分離方法，利用酶消化法、IgG貼壁法和免疫磁珠技術(shù)等分離得到高純度的原代ATI，并初步觀察其生物學(xué)特性，為研究以ATI損傷為特征的肺部疾病提供可靠的體外模型。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠，體重約120g，由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(渝)2012-0005，使用許可證號(hào)SYXK(渝)2012-0010。

1.2 主要試劑及儀器 EDTA、EGTA、DAPI(Sigma公司)，Dispase(BD公司)，DNase Ⅰ、兔抗大鼠Podoplanin多克隆抗體(Sigma-Aldrich公司)，高糖DMEM培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基(Hyclone公司)，胎牛血清(FBS，Gibco公司)，大鼠IgG(中杉金橋公司)，磁珠包被的抗兔IgG(Miltenyi Biotec公司)，山羊抗大鼠小窩蛋白1(caveolin-1，Cav-1)多克隆抗體、兔抗大鼠水通道蛋白5(AQP5)多克隆抗體、兔抗大鼠Ki67(Abcam公司)，兔抗大鼠表面活性蛋白C前體(pro-SPC)多克隆抗體(Millipore公司)，驢抗山羊IgG/AF549、驢抗兔IgG/AF488(Invitrogen公司)，山羊抗兔IgG/TRITC(中杉金橋公司)，正常驢血清(Jackson公司)。CO2培養(yǎng)箱(Thermo公司)，倒置顯微鏡(Leica公司)，活細(xì)胞工作站(API公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 肺臟單細(xì)胞懸液的制備 大鼠稱重、麻醉，全身肝素化，采用無菌PBS(含50U/ml肝素)灌肺至完全變白；用37℃預(yù)熱的PBS(pH7.4，5mmol/L EGTA，5mmol/L EDTA)灌洗肺泡腔3次；向肺中灌入10ml預(yù)熱的Dispase(10U/ml)，37℃消化40min，其間配合機(jī)械搖動(dòng)；消化完畢后保留肺葉，加入1ml分散液(RPMI 1640培養(yǎng)基，20% FBS，100μg/ml DNase Ⅰ)，充分剪碎；用100μm濾網(wǎng)過濾1次、40μm濾網(wǎng)過濾2次后收集濾液，離心棄上清，重懸細(xì)胞沉淀，獲得單細(xì)胞懸液。

1.3.2 ATI的純化 將單細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至大鼠IgG包被的培養(yǎng)皿中，37℃孵育60min。收集未貼壁細(xì)胞，離心后重懸于0.5ml 抗體孵育液中(RPMI 1640培養(yǎng)基，1%FBS，50μg/ml DNase Ⅰ)；加入5μg兔抗大鼠T1α，4℃搖床上孵育35min，用PBS(pH7.2，0.5%BSA，2mmol/L EDTA)漂洗2次，將細(xì)胞離心后重懸于80μl抗體孵育液中，加入20μl磁珠標(biāo)記的山羊抗兔IgG，4℃孵育15min；用PBS(pH7.2，0.5%BSA，2mmol/L EDTA)漂洗1次后過分選柱2次；用PBS(pH7.2，0.5%BSA，2mmol/L EDTA)漂洗4次，每次0.5ml；取出分選柱，收集陽性細(xì)胞。取少量進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和臺(tái)盼藍(lán)染色判斷活力。

1.3.3 ATI的培養(yǎng) 細(xì)胞以2×104/cm2密度接種于培養(yǎng)皿中，加入高糖DMEM培養(yǎng)基、10%FBS、100μg/ml青霉素和鏈霉素，在5%CO2、37℃恒溫育箱中孵育。

1.3.4 ATI的純度鑒定 計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106個(gè)/ml，細(xì)胞爬片，次日將玻片放在丙酮溶液中并置于冰上固定15min，10%山羊血清37℃封閉1h，加入驢抗山羊IgG/AF549(1:400)，37℃避光孵育1h，DAPI染核，封片，觀察并采集熒光。鏡下隨機(jī)視野計(jì)數(shù)細(xì)胞，計(jì)算陽性細(xì)胞百分比。

1.3.5 ATI表型鑒定 取培養(yǎng)5d的ATI細(xì)胞爬片放在丙酮溶液中并置于冰上固定，10%山羊血清封閉，實(shí)驗(yàn)組加入一抗(山羊抗大鼠Caveolin-1多克隆抗體，工作濃度1:100；兔抗大鼠AQP5多克隆抗體，工作濃度1:400；兔抗大鼠proSPC多克隆抗體，工作濃度1:1000；兔抗大鼠Ki67抗體，工作濃度1:200)孵育液，對(duì)照組加等量PBS，4℃過夜孵育，次日在37℃孵箱中復(fù)溫；加入二抗(驢抗山羊IgG/AF594，工作濃度1:400；山羊抗兔IgG/TRITC，工作濃度1:200；驢抗兔IgG/AF488，工作濃度1:400；驢抗兔IgG/AF488，工作濃度1:400)孵育液，37℃避光孵育，DAPI染核。

1.3.6 生長曲線的繪制 取原代分離的ATI接種于12孔板，每孔2×104個(gè)細(xì)胞，共接種2板。48h后開始計(jì)數(shù)，以后每隔48h計(jì)數(shù)1次，每次計(jì)數(shù)3孔，計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。具體計(jì)數(shù)方法：吸棄培養(yǎng)孔的培養(yǎng)基，PBS漂洗2次，加入0.5ml預(yù)熱的0.25%胰酶，37℃消化5～7min，其間輕拍孔底數(shù)次，待鏡下觀察見全部細(xì)胞懸浮后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1.5ml EP管，1000r/min離心5min，棄上清，用100μl PBS重懸細(xì)胞，充分混勻，取10μl細(xì)胞計(jì)數(shù)，數(shù)4個(gè)大格中的細(xì)胞總數(shù)。每孔的細(xì)胞數(shù)=(4大格細(xì)胞總數(shù)/4)×104×0.1。

2 結(jié) 果

2.1 ATI的產(chǎn)量及活力 每只體重120g左右的SD雄性大鼠可分離獲得的ATI細(xì)胞數(shù)為(2.1±0.5)×106個(gè)，臺(tái)盼藍(lán)染色顯示其活力為93.8%±1.6%。

2.2 ATI純度鑒定 分離出細(xì)胞后進(jìn)行細(xì)胞爬片，免疫熒光染色檢測其T1α的表達(dá)，結(jié)果顯示其陽性率為91.0%±0.6%(圖1A–C)，分選陰性細(xì)胞不表達(dá)T1α(圖1D)。

2.3 ATI的生物學(xué)特性

2.3.1 ATI的生長規(guī)律 倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的生長規(guī)律，培養(yǎng)1d時(shí)，細(xì)胞貼壁但是仍然保持圓形以及致密狀(圖2A)。培養(yǎng)3d時(shí)，ATI完全貼壁、伸展，出現(xiàn)偽足(圖2B)，包括板狀偽足和絲狀偽足。培養(yǎng)7d時(shí)，細(xì)胞匯合形成單層扁平狀，形態(tài)多樣，呈多邊形、類圓形、梭形(圖2C)。

2.3.2 ATI表型檢測 培養(yǎng)5d的細(xì)胞呈單層扁平狀，呈多邊形，免疫熒光染色顯示Cav-1、AQP5陽性，pro-SPC陰性(圖3)。

圖1 細(xì)胞純度的鑒定(DAPI ×200)Fig. 1 Purity identification of alveolar type Ⅰ cells (DAPI ×200)

圖2 原代培養(yǎng)ATI的形態(tài)(倒置顯微鏡 ×200)Fig. 2 Morphology of primary cultured alveolar type Ⅰ cells (Inverted microscope ×200)

圖3 原代培養(yǎng)ATI的表型(DAPI ×600)Fig. 3 Phenotype of primary cultured alveolar type Ⅰ cells (DAPI ×600)

2.3.3 ATI的增殖能力 接種第1～3天，細(xì)胞貼壁、伸展，數(shù)量較穩(wěn)定，從第4天開始，細(xì)胞生長加速，約第8天開始進(jìn)入對(duì)數(shù)增長期，對(duì)數(shù)增長期細(xì)胞倍增時(shí)間約為66h，直至第12天細(xì)胞出現(xiàn)接觸抑制、增殖減慢。體外培養(yǎng)的細(xì)胞生長曲線見圖4。免疫熒光檢測顯示，體外培養(yǎng)的ATI表達(dá)增殖相關(guān)抗原Ki67，表明其能夠體外增殖。

3 討 論

肺臟是一個(gè)具有多重組織結(jié)構(gòu)的復(fù)雜的分支器官，由來自內(nèi)胚層和中胚層的多種細(xì)胞組成，據(jù)估計(jì)含有40～60種細(xì)胞[10]。肺臟由于其獨(dú)特的解剖結(jié)構(gòu)及與外界相通的特征，是各種危重疾病時(shí)最易受累的靶器官，如在嚴(yán)重創(chuàng)傷時(shí)易出現(xiàn)急性肺損傷(acute lung injury，ALI)[11]。肺損傷后修復(fù)的關(guān)鍵之一是肺泡上皮的修復(fù)，既往相關(guān)研究主要關(guān)注于ATⅡ，但近年發(fā)現(xiàn)ATI可能不只是傳統(tǒng)意義上的終末分化細(xì)胞，同時(shí)還具有多種生物學(xué)功能[2]。Yamamoto等[12]研究發(fā)現(xiàn)在肺炎球菌引起的肺炎中ATI參與了固有免疫反應(yīng)。Wong等[13]研究發(fā)現(xiàn)采用LPS刺激ATI細(xì)胞能夠產(chǎn)生細(xì)胞因子，且該效應(yīng)受腎素-血管緊張素系統(tǒng)調(diào)節(jié)。以上研究表明ATI除了傳統(tǒng)的對(duì)水和離子的轉(zhuǎn)運(yùn)功能外，還具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用。因此，分離出高純度的ATI對(duì)以其損傷為特征的肺部疾病的體外研究具有重要意義。

圖4 ATI生長曲線Fig. 4 Growth curve of primary cultured alveolar type Ⅰ cells

本研究參照已報(bào)道的分離純化ATI的方法[6-9]，并結(jié)合實(shí)際情況進(jìn)行了改良。首先，關(guān)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇，各實(shí)驗(yàn)室差別較大，所用動(dòng)物體重從100～300g不等，本研究選擇120g左右的SD大鼠，因?yàn)樵擉w重大鼠肺泡已經(jīng)發(fā)育成熟[14]，且肺部質(zhì)量較好。第二，關(guān)于消化酶的選擇，目前國內(nèi)文獻(xiàn)分離肺泡上皮細(xì)胞多采用胰蛋白酶，國外文獻(xiàn)通常采用彈性蛋白酶。胰酶消化后獲取的細(xì)胞特異性不強(qiáng)，且對(duì)細(xì)胞損傷較大，彈性蛋白酶雖然對(duì)上皮具有一定特異性，對(duì)細(xì)胞損傷較小，但是價(jià)格昂貴，不易獲得。本研究采用的中性蛋白酶又稱分散酶，是一種非特異性的金屬蛋白酶，作用迅速有效且溫和，能保持細(xì)胞的完整性，對(duì)細(xì)胞膜無損傷，同時(shí)該酶為非哺乳動(dòng)物來源，無被支原體或動(dòng)物病毒污染的風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)溫度、pH改變以及血清成分都很穩(wěn)定，已被廣泛應(yīng)用于肺臟干/祖細(xì)胞的分離。第三，在純化步驟中，采用大鼠IgG貼壁篩選去除細(xì)胞膜上具有Fc片段的免疫細(xì)胞(主要是巨噬細(xì)胞)，因?yàn)椴糠志奘杉?xì)胞和其他免疫細(xì)胞亞群也表達(dá)ATI特異性標(biāo)志物T1α[15]；貼壁時(shí)間選擇60min，因?yàn)闀r(shí)間過長ATI細(xì)胞也會(huì)貼壁[11]。第四，在分選步驟中，以T1α作為特異性標(biāo)志物，通過磁珠分選獲得高純度的ATI，與流式分選相比，該方法的操作相對(duì)簡單，分離時(shí)間短，對(duì)細(xì)胞的損傷小，獲得細(xì)胞的活力好。

本研究通過倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長狀況、采用免疫熒光檢測其特異性蛋白的表達(dá)、繪制細(xì)胞生長曲線了解所獲ATI的生物學(xué)特性。結(jié)果顯示，ATI細(xì)胞呈集落樣生長，胞質(zhì)豐富，培養(yǎng)7d后匯合形成單層扁平樣細(xì)胞。免疫熒光檢測時(shí)選擇T1α[15]、AQP5[16]、Caveolin-1[17]作為陽性標(biāo)志物，因?yàn)樗鼈冊诜闻K中特異性表達(dá)于ATI。T1α是一種高度保守的跨膜蛋白，在正常組織和腫瘤中均可表達(dá)，對(duì)心臟、肺、淋巴系統(tǒng)的發(fā)育具有重要作用[5,15]。AQP5是水通道蛋白的一個(gè)亞群，參與水的代謝[16]，免疫熒光染色可見其在胞膜上有一定聚集現(xiàn)象，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[6,9]，但是具體原因目前尚不清楚，可能與AT1細(xì)胞的功能相關(guān)，因?yàn)锳T1細(xì)胞參與氣血屏障的形成，在水和離子轉(zhuǎn)運(yùn)過程中發(fā)揮重要作用。Caveolin-1是膜整合蛋白，在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、膽固醇代謝、細(xì)胞內(nèi)化及腫瘤轉(zhuǎn)移、肌細(xì)胞合成等方面具有重要作用[17]。生長曲線顯示ATI和傳統(tǒng)意義上的終末分化細(xì)胞不同，在體外能夠增殖，對(duì)數(shù)生長期的倍增時(shí)間約為66h。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過改良單細(xì)胞制備及分選操作從成年大鼠肺臟中分離出了純度較高的ATI，并初步觀察了其生物學(xué)特性，培養(yǎng)后細(xì)胞生長良好，可以為后續(xù)以ATI損傷為特征的肺部疾病的研究提供可靠的體外模型。

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