李潔，傅勇輝，吳瓊，孫萬(wàn)磊，袁鏗

(1、南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院 江西省分子醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330006；2、江西省精神病醫(yī)院，江西 南昌330029；3、江西省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院，江西 南昌 330006)

間充質(zhì)干細(xì)胞 (mesenchymal stem cell,MSC)是近年來(lái)一種重要的種子細(xì)胞,它不僅具有支持造血、調(diào)節(jié)免疫的功能，而且在一定條件條件下能分化成為骨、軟骨、脂肪、肌肉等組織被應(yīng)用于組織工程及各種疾病的治療，具有廣闊的臨床前景。身體的各種組織均具有MSC的存在，現(xiàn)在MSC主要來(lái)源于骨髓、臍血和臍帶。骨髓源性MSC存在高度病毒污染的可能,且隨著年齡增長(zhǎng)其細(xì)胞數(shù)量和擴(kuò)增、分化能力出現(xiàn)明顯下降趨勢(shì)。胎兒臍血MSC含量非常低,且其分離會(huì)損失臍血造血干細(xì)胞,影響臍血凍存。故尋找一種新的MSC來(lái)源,已成為細(xì)胞組織工程研究的熱點(diǎn)。我們?cè)O(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)利用被人們所廢棄的臍帶培養(yǎng)出MSC，并對(duì)培養(yǎng)出的MSC進(jìn)行生物學(xué)特性的鑒定，同時(shí)將傳代后的細(xì)胞凍存復(fù)蘇觀察凍存復(fù)蘇對(duì)其生物學(xué)特性的影響，為臍帶MSC的保存從而被更廣泛的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 采集正常分娩胎兒臍帶組織標(biāo)本。方法：UC-MSC的分離培養(yǎng)：臍帶以75%酒精浸泡10min后剪成5cm左右的小段，以PBS沖洗3遍后剝?nèi)パ芗巴饽?，將去除血管及外膜的臍帶剪成長(zhǎng)條狀并以1mg/ml膠原Ⅱ置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中消化18～21h。取出臍帶，消化液加PBS稀釋降低黏度，2000r/min離心20min,棄上清液,PBS洗滌3次。所得細(xì)胞均用臺(tái)盼藍(lán)染色,細(xì)胞計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml,用含體積分?jǐn)?shù)為10%FBS的DMEM-LG培養(yǎng)基接種于一次性T75培養(yǎng)瓶中,置飽和濕度、5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。7d后半量換液,去除懸浮細(xì)胞,以后3～4d換液1次。待細(xì)胞80%融合后以吸管吹打貼壁胞,以1∶3傳代培養(yǎng),取P3代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，并將部分P3代的細(xì)胞凍存用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

1.2 UC-MSC表面CD分子的鑒定 將傳至P3代的UC-MSC以及凍存復(fù)蘇后的細(xì)胞以1:1的0.25%和0.04%EDTA消化后,PBS洗滌3次,分成每EP(1.5ml)管1×105細(xì)胞,分別加入小鼠抗人直標(biāo)PE或 FITC單抗CD13、CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD166、HLA-DR、HLA-Ⅰ等 10μl,室溫避光反應(yīng)30min,設(shè)立陰性同型對(duì)照。PBS洗滌3次后,進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析。

1.3 體外MSC定向誘導(dǎo)分化 實(shí)驗(yàn)分組：A.陰性對(duì)照組：正常MSC的培養(yǎng)液；B.實(shí)驗(yàn)組：加入下列不同的誘導(dǎo)液。

1.3.1 體外MSC向脂肪誘導(dǎo)分化 取P3代的UCMSC液100μl(1×106/ml)接種于事先放置有經(jīng)多聚賴氨酸處理的消毒蓋玻片的24孔板內(nèi)制備細(xì)胞爬片,每組3孔。誘導(dǎo)分化體系為10%FBS、1mmol/L地塞米松、0.5mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌啉、10ug/ml胰島素、100μmol/L消炎痛,3～4d換液 1次,3周后以0.5%油紅O染色,蘇木素復(fù)染后顯微鏡下觀察。

1.3.2 體外MSC向軟骨誘導(dǎo)分化 取P3代的UCMSC液100μl(1×106/ml)接種于事先放置有經(jīng)多聚賴氨酸處理的消毒蓋玻片的24孔板內(nèi)制備細(xì)胞爬片,每組3孔。誘導(dǎo)分化體系為含10%FBS、0.1μmol/L地塞米松、50μmol/L維生素 C、10ng/mlTGF-β1誘導(dǎo)培養(yǎng)液1ml進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng),3～4d換液1次,3周后以阿新蘭染色鑒定。

2 結(jié)果

2.1 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定 臍帶源性MSC原代21～28d融合80%,P3代5～7d細(xì)胞80%融合以成纖維樣細(xì)胞為主,呈漩渦狀排列生長(zhǎng),傳至P3代細(xì)胞多呈長(zhǎng)梭形,排列有明顯方向性,細(xì)胞排列成網(wǎng)狀、輻射狀,復(fù)蘇后形態(tài)也無(wú)改變(圖1)。

2.2 UC-MSC表面CD分子的鑒定 復(fù)蘇前后MSC均表達(dá)黏附分子和基質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記CD29、CD105、CD166、CD90 ，不表達(dá)造血細(xì)胞標(biāo)記 CD13、CD34、CD45，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖2、圖3)。

圖2 間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞表面分子表達(dá)流式圖

圖3 正常組與凍存復(fù)蘇組細(xì)胞表面標(biāo)志比較圖

2.3 體外MSC定向誘導(dǎo)分化

2.3.1 體外MSC向脂肪誘導(dǎo)分化 MSC誘導(dǎo)組可見(jiàn)油紅O染色后為紅色陽(yáng)性的脂肪細(xì)胞(圖4)。

圖4 體外MSC向脂肪定向誘導(dǎo)分化

2.3.2體外MSC向軟骨誘導(dǎo)分化 MSC誘導(dǎo)組可見(jiàn)阿新蘭染色后為藍(lán)色色陽(yáng)性的脂肪細(xì)胞(圖5)。

圖5 體外MSC向軟骨定向誘導(dǎo)分化

3 討論

近來(lái)國(guó)內(nèi)外已有許多研究證實(shí)從臍帶的不同部位(臍帶靜脈內(nèi)皮,內(nèi)皮下層,Wharton's jelly,血管及其周?chē)M織)均可分離得到MSC[1]。本研究采用膠原酶消化法從臍帶中分離培養(yǎng)的細(xì)胞,形態(tài)上呈長(zhǎng)梭形,排列有明顯方向性具有典型的MSC形態(tài)特征,流式檢測(cè)結(jié)果更表明其細(xì)胞表面抗原標(biāo)志與以往報(bào)道的骨髓、臍血MSC相同，并且在體外證實(shí)其具有多向分化的功能，經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)能夠分化成為脂肪、成骨及軟骨等多種組織[2-6]。因此,臍帶分離到的貼壁細(xì)胞也屬于MSC，并證實(shí)臍帶MSC具有與骨髓、臍血MSC相同的生物學(xué)特征。另外,本研究不同于以往的胰酶消化收集細(xì)胞的方式,采用膠原酶消化臍帶,主要作用于細(xì)胞間的膠原組織,不容易損傷細(xì)胞膜,更有利于細(xì)胞的體外培養(yǎng)。同時(shí)，我們對(duì)凍存前后的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)、表型及多向分化能力進(jìn)行了比較，證實(shí)凍存復(fù)蘇后的細(xì)胞與未凍存的細(xì)胞具有相同的生物學(xué)特征。臍帶作為分娩的廢棄物,具有來(lái)源廣泛,采集相對(duì)簡(jiǎn)單,對(duì)供者無(wú)任何損傷,且MSC含量豐富,免疫原性低,不表達(dá)HLA-DR等優(yōu)點(diǎn)。因此，臍帶作為一種新的MSC來(lái)源,可以避免獲得骨髓源性MSC來(lái)源受限、易污染、采集給患者帶來(lái)痛苦的缺點(diǎn)，又可避免胎兒臍血MSC含量非常低,培養(yǎng)成功率低的缺點(diǎn)，可成為臍血和骨髓MSC的替代來(lái)源,廣泛地用于科研和臨床前試驗(yàn)具有廣闊的應(yīng)用前景。同時(shí)，我們的實(shí)驗(yàn)證實(shí)臍帶MSC凍存后能仍保持其完整的生物學(xué)特征使其的應(yīng)用更方便有利。

[1]Margossian T,Reppel L,Makdissy N,et al.Mesenchymal stem cells derived from Wharton's jelly:Comparative phenotype analysis between tissue and in vitro expansion[J].Biomed Mater Eng,2012,22(4):243-254.

[2]Zhang H,Zhang B,Tao Y,et al.Isolation and characterization of mesenchymal stem cells from whole human umbilical cord applying a single enzyme approach[J].Cell Biochem Funct,2012,30(8):643-649.

[3]Zhang L,Ye JS,Decot V,et al.Research on stem cells as candidates to be differentiated into hepatocytes[J].Biomed Mater Eng,2012,22(1):105-111.

[4]Fan CG,Zhang QJ,Zhou JR.Therapeutic potentials of mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord[J].Stem Cell Rev,2011,7(1):195-207.

[5]Berg L,Koch T,Heerkens T,et al.Chondrogenic potential of mesenchymal stromal cells derived from equine bone marrow and umbilical cord blood[J].Vet Comp Orthop Traumatol,2009,22(5):363-370.

[6]Cheng H,Qiu L,Ma J,et al.Replicative senescence of human bone marrow and umbilical cord derived mesenchymal stem cells and their differentiation to adipocytes and osteoblasts[J].Mol Biol Rep,2011,38(8):5161-5168.