陳順平 余英豪 吳文喬 周宗楷 謝飛來 沈洪武 王 烈

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，隨著分子生物學(xué)技術(shù)普遍應(yīng)用，近年來對乳腺癌深入的研究提示了人類表皮生長因子受體2(Her-2)與乳腺癌的關(guān)系尤其密切［1］，與腫瘤發(fā)生發(fā)展與預(yù)后相關(guān)，有25%～30%的浸潤性乳腺癌和80%的乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌患者有Her-2基因擴增或蛋白過表達［2］，但對乳腺癌相關(guān)染色體倍體性與腫瘤惡性程度相關(guān)的研究較少，結(jié)論也不一致。有學(xué)者認為乳腺癌二體性腫瘤比多體性腫瘤預(yù)后為好［3］，但也有研究者得出完全相反的結(jié)論［4］。熒光原位雜交(FISH)技術(shù)是現(xiàn)今常用的分子技術(shù)，可檢測基因的擴增及染色體倍體性。因此，本研究應(yīng)用了FISH及免疫組化(IHC)技術(shù)，檢測浸潤性乳腺癌中Her-2表達情況和17號染色體倍體性情況及其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系，并分析其臨床病理意義。

1 材料與方法

1.1 材料

收集2010年5月－2012年12月我院收治的臨床資料完整的300例浸潤性乳腺癌，年齡25～89歲，中位44.5歲;其中年齡 ＜50歲158例，≥50歲142例。所有標本經(jīng)10%中性緩沖福爾馬林液固定，常規(guī)石蠟包埋。同時進行IHC及FISH檢測。

1.2 主要試劑與儀器

酸性亞硫酸鈉(美國Simga產(chǎn)品)，蛋白酶K(美國羅氏產(chǎn)品)，探針:［GLP Her-2/CSP17探針］(購于北京金菩嘉公司)，Olympus BX51型熒光顯微鏡，Dake原位雜交儀，電熱恒溫水槽，隔水式恒溫培養(yǎng)箱。免疫組化試劑購于福州邁新生物公司，標記均設(shè)陽性對照，并用PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照。

1.3 方法

1.3.1 FISH檢測及其結(jié)果判斷 方法:①將3 μm組織涂膠切片浸于二甲苯中脫蠟至水。②50℃30%酸性亞硫酸鈉處理組織切片30～40 min。③室溫下2×SSC×3 min×2次漂洗。④在組織中滴加自配即用型蛋白酶K，37℃預(yù)熱孵育盒中消化20～25 min。⑤室溫下2×SSC×3 min×2次漂洗，乙醇梯度脫水固定，自然干燥。⑥避光環(huán)境中，配制探針混合液(7 μl雜交緩沖液、1 μl去離子水和2 μl探針)并滴于雜交區(qū)域，83℃自動雜交儀中變性6 min后置37℃過夜雜交。⑦洗滌:次日移去蓋玻片，46℃下，玻片置于2×SSC×10 min×2次，2×SSC/0.1%NP-40溶液中 5 min。玻片干燥后加DAPI復(fù)染液，置于暗盒中復(fù)染數(shù)分鐘后，在OLYMPUS BX51熒光顯微鏡DAPI/FIFC/RHOD三色濾光鏡激發(fā)下觀察間期細胞熒光雜交信號。結(jié)果判定:①Her-2基因:計數(shù)細胞核內(nèi)紅色的Her-2基因熒光信號和17號染色體的綠色熒光信號的數(shù)目比值，即Ratio值(Ratio=30個細胞核中紅色信號總數(shù)/綠色信號總數(shù))。Ratio值＜1.8為陰性，提示無基因擴增;Ratio＞2.2為陽性，提示基因擴增;Ratio在1.8～2.2時，增加計數(shù)細胞，重新對比。②17號染色體多體性標準:每個細胞中17號染色體數(shù)目在1.76～2.25 為二體性，≥2.26 為多體性［5］。

1.3.2 IHC檢測 方法及主要步驟:采用EnVision兩步法，嚴格按照說明書進行操作。結(jié)果判定:①Her-2蛋白判斷標準(2009年最新修訂意見):癌細胞胞膜著色為陽性染色，≥30%的腫瘤細胞呈現(xiàn)強及完整的細胞膜著色為陽性(+++)，輕及中度完整的細胞膜著色為可疑(++)，不完整染色或無染色為陰性(+或－)。②ER和PR蛋白判定標準:顯微鏡下計數(shù)100個腫瘤細胞中陽性細胞數(shù)，以任意5個高倍鏡視野中陽性細胞占細胞總數(shù)的百分數(shù)以及核染色程度作為評定依據(jù)，陽性細胞數(shù)≤5%為0分;6% ～25%為1分;26% ～50%為2分;＞50%為3分。染色強度:無色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。上述兩項得分的乘積，為其最后得分。同一視野如有染色強度不一，取其平均值作為最后得分。0～1分為陰性(－)，2～3分為弱陽性(+)，4～6分為中等陽性(++)，6分以上為強陽性(+++)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，結(jié)果比較采用卡方檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 17號染色體多體與Her-2基因擴增及蛋白表達的關(guān)系

300例浸潤性乳腺癌標本中，17號染色體多體106例，占 35.33%;Her-2基因擴增 101例，占33.67%。Her-2基因擴增病例中17號染色體多體占55.44%(56/101)，無擴增病例中其占 25.13%(50/199);本組 Her-2蛋白(－ /+)163例(54.33%)，Her-2蛋白(++/+++)137例(45.67%)，Her-2蛋白(－/+)中17號染色體多體占15.34%(25/163)，Her-2蛋白(++/+++)中其占59.12%(81/137)，差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P均＜0.01)(表1)。

2.2 17號染色體多體與浸潤性乳腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

17號染色體多體與患者年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期均無相關(guān)性(P均＞0.05，表1)。

表1 17號染色體倍體性與浸潤性乳腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系/例

3 討論

Her-2是1種原癌基因，定位于17號染色體，主要參與腫瘤細胞生長、增殖及分化，其過度表達常提示腫瘤惡性程度高、預(yù)后差，但該基因擴增的患者使用赫賽汀效果好，這已在諸多有關(guān)乳腺癌報道中得到證實。而有關(guān)17號染色體的研究較少，且結(jié)果也不盡相同，有13%～46%的浸潤性乳腺癌患者癌細胞為17號染色體多體，多體可能與乳腺癌的預(yù)后有關(guān)［5-6］，但也有一些學(xué)者提出相反的結(jié)論［7］。FISH和IHC技術(shù)是現(xiàn)今較常用基因擴增與蛋白表達檢測的方法，不僅準確率高，操作也簡便，已在臨床普及應(yīng)用，而且FISH能定量出l7號染色體的倍體性，這2種方法相互補充可為有效判斷乳腺癌預(yù)后提供更多的理論依據(jù)。

本文應(yīng)用FISH和IHC技術(shù)，對300例乳腺癌患者的Her-2及17號染色體進行檢測，結(jié)果顯示300例浸潤性乳腺癌標本中，17號染色體多體占35.33%，與國內(nèi)外文獻報道相一致。17號染色體多體在Her-2基因擴增中占55.44%;無擴增中占25.13%，而在Her-2蛋白(－ /+)占15.34%;(++/+++)占 59.12%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，提示浸潤性乳腺癌中17號染色體多體性更多的表現(xiàn)在Her-2方面，隨著Her-2基因擴增或者蛋白表達加強，多體情況不斷增加，同時結(jié)果也表明了17號染色體多體與Her-2的表達密切相關(guān)，可能是在Her-2表達異常時，癌組織細胞染色體更加不穩(wěn)定造成的。且這種現(xiàn)象可能影響了Her-2基因或蛋白結(jié)果判斷的不確定性，由于染色體增加引起了Her-2基因位點的增加，可能造成了Her-2蛋白表達相應(yīng)增強，而根據(jù)判斷標準Her-2基因并未擴增，這種現(xiàn)象可能是2種方法在檢測Her-2蛋白(++/+)結(jié)果不一樣的主要原因。所以FISH檢測Her-2基因擴增判斷標準中以17號染色體為內(nèi)參照，一方面可以代表實驗的內(nèi)質(zhì)控情況，判斷實驗是否成功。如果組織細胞酶消化不合適情況下，無17號染色體綠色信號，單靠HER-2紅色信號判斷，很容易造成假陰性或假陽性。另一方面可以排除17號染色體多體引起了假擴增。但是IHC方面沒有內(nèi)參照，而根據(jù)表1染色體多體可能是IHC假陽性原因，說明FISH在檢測基因擴增的同時還應(yīng)檢測17號染色體倍體性，其結(jié)果比IHC更穩(wěn)定，更準確。近來Varga等［8］認為乳腺癌中Her-2基因和17號染色體著絲?？赡艽嬖诠餐瑪U增。國內(nèi)學(xué)者楊飛等［9］也對此進行相關(guān)討論。也有學(xué)者把著絲粒附近的基因如p53、SMS或RARA作為代替17號染色體著絲粒作為內(nèi)參照，發(fā)現(xiàn)部分乳腺癌患者Her-2狀態(tài)由無擴增變?yōu)閿U增的現(xiàn)象［10-11］，所以他們認為Her-2基因擴增判斷標準中以17號染色體著絲粒為內(nèi)參照不準確，我們認為上述學(xué)者的結(jié)論應(yīng)得進一步探討，如果存在共擴增的話，有Her-2基因擴增的組織細胞內(nèi)簇狀紅色信號應(yīng)該也存在同樣成簇狀的17號染色體著絲粒綠信號，然而，我們在實際FISH檢測中并未發(fā)現(xiàn)。且Her-2擴增或無擴增情況下綠色信號數(shù)大部分都在6個信號點以下，所以我們認為應(yīng)該不存在會造成Her-2擴增引起17號染色體著絲粒共擴增的現(xiàn)象。且著絲粒DNA序列比p53、SMS或RARA等基因更加穩(wěn)定，而著絲粒DNA序列中發(fā)生基因擴增，片段插入、缺失等突變較少，是相對保守的DNA序列，而一般探針的設(shè)計也是選擇著絲粒最為保守的一段堿基對作為染色體探針代表。但是p53、SMS或RARA等基因發(fā)生基因突變幾率較大，特別是p53發(fā)生缺失是腫瘤發(fā)生發(fā)展的常見的表現(xiàn)形式，一旦發(fā)生基因突變，根據(jù)判斷標準說明Her2基因有無擴增并不準確。所以我們認為以17號染色體著絲粒為內(nèi)參照較為準確。

在本組病例所得結(jié)果中，17號染色體多體顯示了與Her-2不同的遺傳學(xué)特征，在發(fā)病年齡，TNM分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等與多倍體組無明顯差異，說明其不是影響腫瘤發(fā)展相關(guān)因素，與腫瘤發(fā)展無明顯聯(lián)系，可能只是乳腺癌引起了1種染色體不穩(wěn)定的表現(xiàn)。同時，表1結(jié)果中17號染色體在ER、PR(－/+)與(++/+++)有差異，而ER、PR表達與內(nèi)分泌治療之間密切相關(guān)，17號染色體多體的乳腺癌患者是否說明內(nèi)分泌治療效果差，至今尚未清楚，將有待于進一步研究。

綜上所述，我們認為17號染色體多體并未在浸潤性乳腺癌中顯示出不良的病理臨床意義，可能是FISH和IHC方法檢測結(jié)果不同的因素，17號染色體多體是乳腺癌常見遺傳學(xué)改變，是乳腺癌引起的1種染色體不穩(wěn)定表現(xiàn)形式。其多體性與乳腺癌病情發(fā)展無關(guān)。

［1］Arteaga CL.Epidermal growth factor receptor dependence in human tumors:more than just expression?〔J〕.Oncologist，2002，7(4):31-39.

［2］Ross JS，Gray GS.Targeted therapy for cancer:the Her-2/neu and Herceptin story〔J〕.Clin Leadersh Manag Rev，2003，17(6):333-340.

［3］Takehisa M，Sasa M，Bando Y，et al.Chromosomal aneusomy(chr 1，11，17)detected by f1uorescence in situ hybridization may be a prognostic factor in breast cancer〔J〕.Anticancer Res，2007，27(2):1073-1078.

［4］Mottolese M，0rlandi G，Sperduti I，et al.Biopathologic characteristics re1ated to chromosome 11 aneusomy and cyclin D1 gene status in surgical1y resected stage I andⅡbreast cancer:Identification of an adverse prognostic profile〔J〕.Am J Surg Pathol，2007，31(2):247-254.

［5］Torrisi R，Rotmensz N，Baqnardi V，et al.HER2 status in early breast cancer:relevance of cell staining patterns，gene amplification and polysomy 17〔J〕.Eur J Cancer，2007，43(16):2339-2344.

［6］Vanden B I，Van L P，Drijkoningen M，et al.Polysomy 17 in breast cancer:clinicopathologic significance and impact on Her-2 testing〔J〕.J Clin Oncol，2008，26(30):4869-4874.

［7］Risio M，Casorzo L，Redana S，et al.HER2 gene-amplified breast cancers with monosomy of chromosome 17 are poorly responsive to trastuzumab-based treatment〔J〕.Oncol Rep，2005，13(2):305-309.

［8］Varga z，Tubbs RR，Wang Z，et al.Co-amplification of the HER2 gene and chromosome 17 centromere:a potential diagnostic pitfall in HER-2 testing in breast cancer〔J〕.Breast Cancer Res Treat，2012，132(3):925-960.

［9］楊 飛，楊文濤，步 宏.乳腺癌HER2檢測中的新問題〔J〕.中華病理學(xué)雜志，2012，41(5):289-292.

［10］Ross JS.Human epidermal growth fator receptor 2 testing in 2010:does chromosome 17 centromere copy humber make any difference?〔J〕.J Clin OntoI，2010，28(28):4293-4295.

［11］Tse CH，Hwang HC，Goldstein Lc，et al.Determining true-HER2 gene status in breast with polysomy by using alternative chromosome 17 refereuce genes:implications for anti-HER targeted therapy〔J〕.J Clin Oncol，2011，29(31):4168-4174.