吉沐祥等

摘要：為探明生物殺菌劑對草莓枯萎病菌的室內(nèi)抑菌活性，采用菌絲生長速率法測定了8種生物殺菌劑對草莓枯萎病的室內(nèi)抑菌活性。結(jié)果表明，申嗪霉素、寡雄腐霉、超敏蛋白、嘧啶核苷類抗菌素、乙蒜素、氨基寡糖素、井岡霉素、春雷霉素對草莓枯萎病菌的EC50分別為0.790 2、5.256 9、6.911 0、10.855 5、27.623 2、29.558 4、29.976 1、35.584 1 μg/mL。草莓枯萎病菌對8種生物殺菌劑的敏感性差異較大，供試草莓枯萎病菌對申嗪霉素最敏感，其次為寡雄腐霉。

關(guān)鍵詞：草莓枯萎病菌；生物殺菌劑；抑菌活性

中圖分類號： S436.67+4文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）09-0103-03

收稿日期：2014-06-15

基金項目：江蘇省科技支撐計劃（編號：BE2012378）；江蘇省“六大人才高峰”項目（編號：2013-NY-001）；江蘇省鎮(zhèn)江市農(nóng)業(yè)科技支撐計劃（編號：NY2013014）。

作者簡介：吉沐祥（1963—），男，江蘇寶應人，研究員，主要從事植保農(nóng)藥研究與開發(fā)。E-mail：jilvdun2800@163.com。

通信作者：李國平，研究員。E-mail：jrlgp@126.com。草莓（Fragaria ananassa Duch）以其果實柔軟多汁、味道鮮美、營養(yǎng)豐富、生育期短、結(jié)果早和產(chǎn)量高等特點備受人們喜愛，在國際市場上具有重要的經(jīng)濟地位[1]。草莓枯萎病病原為尖孢鐮刀菌草莓專化型（Fusarium oxysporum f.sp. fragariae），只危害草莓，是重要的土傳病害。該病導致草莓根系壞死，生長不良，矮小衰弱，葉無光澤，下部葉片變紫紅色萎蔫狀，葉柄和果梗的維管束變褐色或黑褐色，最后全株枯死。輕病株則結(jié)果減少，果實不能正常膨大，品質(zhì)低劣。病菌在寄主病殘體內(nèi)以菌絲體或厚垣孢子或擬菌核在土壤中越冬，或在病殘體、混有病殘體的堆肥、種子內(nèi)外越冬，一般可存活6～8年，帶菌土壤是病害侵染的主要來源。環(huán)境條件適宜時，病菌借助帶病母株、土壤、水源、農(nóng)具等進行傳播，從植株根部傷口或直接從幼根的表皮和根毛侵入，在植株維管束內(nèi)繁殖，不斷擴散到植株葉及根系，引起植株系統(tǒng)性發(fā)病，最后干枯死亡。病菌喜溫暖潮濕環(huán)境，發(fā)病最適宜氣候條件為25～28 ℃，相對濕度60%～85%。草莓枯萎病的發(fā)病盛期在育苗中后期、假植期、定植初期。草莓枯萎病危害性大，是頑固性土傳病害，土壤通透性差、過干過濕、多年連作、氮肥過多或有線蟲危害的地塊易導致枯萎病的嚴重發(fā)生[2]。

目前，草莓枯萎病的防治有農(nóng)業(yè)防治、物理防治、化學防治和生物防治等方法。農(nóng)業(yè)防治包括作物輪作、移栽脫毒種苗、選育抗病品種以及高架基質(zhì)栽培等，由于提高了勞動強度、生產(chǎn)成本，或因解除連作障礙的效果不佳等因素，還沒有在草莓種植中廣泛應用。物理防治方法主要是利用高溫土壤消毒技術(shù)，如袁會珠等采用室外小區(qū)試驗方法，在草莓栽培過程中利用客土法、人工基質(zhì)法、太陽能土壤消毒方法防治草莓土傳病害，3種防治方法增產(chǎn)幅度分別高達100%、115%、129%，與溴甲烷土壤消毒差別不大，基本可以替代溴甲烷土壤消毒技術(shù)，但該類方法存在勞動強度大和嚴重環(huán)境污染問題[3]。隨著化學防治導致病原菌抗藥性、農(nóng)藥殘留等問題日益加重，生態(tài)環(huán)境和食品安全受到威脅，因而環(huán)境友好型生物農(nóng)藥是化學農(nóng)藥的最佳替代產(chǎn)品。本研究采用菌絲生長速率法分別測定了8種生物殺菌劑對草莓枯萎病菌的室內(nèi)毒力，并進行了防治草莓枯萎病的室內(nèi)盆栽試驗，以期為草莓枯萎病的防治和新型生物藥劑的研發(fā)提供技術(shù)依據(jù)。

1材料與方法

1.1培養(yǎng)基

馬鈴薯培養(yǎng)基（PDA）[4]，用于草莓枯萎病菌的分離、保存以及毒力測定。

1.2菌株

草莓枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. fragariae），采自鎮(zhèn)江市句容草莓園，由江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學研究所現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究室分離、鑒定，按照柯郝法則（Kochs rule）[5]驗證后保存?zhèn)溆谩＞瓯４嬗赑DA斜面上（4 ℃）。

1.3藥劑

90%乙蒜素（ethylicin），開封大地農(nóng)化生物科技有限公司生產(chǎn)；67.1%井岡霉素（Jinggangmycin），杭州正誠農(nóng)化有限公司生產(chǎn)；65%春雷霉素（kasugamycin），華北制藥股份有限公司生產(chǎn)；95%申嗪霉素（phenazine-1-carboxylic acid），上海農(nóng)樂生物制品股份有限公司生產(chǎn)；80%氨基寡糖素（oligosaccharins），濰坊華諾生物科技有限公司生產(chǎn)；3%超敏蛋白（harpin protein），江蘇省農(nóng)墾生物化學有限公司生產(chǎn)；1.0×106個孢子/g寡雄腐霉（pythium oligandrum），捷克生物制劑有限公司生產(chǎn)；4%嘧啶核苷類抗菌素（pyrimidine nucleoside antibiotics），武漢科諾生物有限公司生產(chǎn)。

1.4儀器設備

電子天平（感量0.1 mg）、GZP-300A培養(yǎng)箱、直徑為 75 mm 的培養(yǎng)皿、三角瓶、移液器、移液管、洗耳球、打孔器、接種刀等。

1.5試驗方法

1.5.1藥液的配制及濃度設計母液配制：將90%乙蒜素和95%申嗪霉素分別用適量丙酮溶解并加入10%的吐溫-80，其他藥劑分別用適量無菌水溶解，各藥劑均配制成 1 000 μg/mL 的母液置于4 ℃冰箱中備用。

不同藥劑在含藥PDA培養(yǎng)基中的濃度設計均為：0.781 25～100.000 00 μg/mL，共8個梯度濃度（表1）。除母液外所有試驗藥劑系列濃度的藥液均為現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.5.2敏感性檢測采用菌絲生長速率法[6]，將保留的草莓枯萎病菌轉(zhuǎn)接到PDA平皿中，在25 ℃下活化96 h，然后在近菌落邊緣用打孔器制取直徑為5 mm的菌餅，并轉(zhuǎn)接到1.4倍比稀釋配制的含藥和空白對照的PDA平皿中，25 ℃培養(yǎng)96 h，待對照中菌落長至約平皿直徑的4/5時，采用十字交叉法量取菌落直徑。

計算菌落直徑均值，按照下列公式計算菌絲生長平均抑制率。菌絲生長平均抑制率=[（對照菌落直徑均值-處理菌落直徑均值）/（對照菌落直徑均值-接種菌餅直徑）]×100%。采用DPS 13.0專業(yè)版數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，計算出各藥劑對草莓枯萎病菌菌絲生長抑制的回歸方程、EC50及其95%置信限，并以最敏感藥劑的EC50值為對照求出相對毒力指數(shù)。

2結(jié)果與分析

2.1不同生物殺菌劑對草莓枯萎病菌絲生長的影響

2.2草莓枯萎病菌對不同生物殺菌劑敏感性的比較

敏感性檢測結(jié)果表明，申嗪霉素、寡雄腐霉、超敏蛋白、嘧啶核苷類抗菌素、乙蒜素、氨基寡糖素、井岡霉素、春雷霉素對草莓枯萎病菌的EC50值分別為0.790 2、5.256 9、6.911 0、10855 5、27.623 2、29.558 4、29.976 1、35.584 1 μg/mL。8種供試生物殺菌劑中，申嗪霉素對草莓枯萎病菌菌絲生長的抑制活性最強，而春雷霉素的抑制活性最低，二者EC50值相差約34.7939 μg/mL。以申嗪霉素的EC50值為對照得出了不同殺菌劑相對毒力指數(shù)，寡雄腐霉、超敏蛋白、嘧啶核苷類抗菌素的相對毒力指數(shù)分別為6.65、8.75、13.74；乙蒜素、氨基寡糖素、井岡霉素、春雷霉素的相對毒力指數(shù)在34～46之間（表2）。表明我國自主開發(fā)的抗生素類生物殺菌劑——申嗪霉素對供試草莓枯萎病菌的抑制活性最強；寡雄腐霉、超敏蛋白、嘧啶核苷類抗菌素對草莓枯萎病菌的抑制活性較強；而井岡霉素和春雷霉素等生物殺菌劑對草莓枯萎病菌的抑制活性相對較弱。表2草莓枯萎病菌對8種生物殺菌劑的敏感性檢測結(jié)果

3結(jié)論與討論

草莓連作障礙問題、草莓枯萎病的防治一直以來都引起了各級植保部門的高度關(guān)注。由于草莓為多年生植物，在同塊地里連續(xù)多年種植后，致使土壤中病菌大量積累，加上品種抗病性下降、田間管理不善等影響因素，導致草莓枯萎病發(fā)病率逐年加重。目前，在抗草莓枯萎病品種缺乏的情況下，選擇適當藥劑并采用合適的施藥方法是防治草莓枯萎病的重要措施。生物防治是防治草莓土傳病害，解除草莓連作障礙技術(shù)研究的熱點。王占武等以拮抗細菌B501在草莓根際進行定植防治草莓黃萎病，連續(xù)2年的田間防效分別達到了939%、968%[7]。馬寶紅等利用VAM 菌根菌（Glomus mosseae 和Glomus versiforme），對草莓有促生、防黃萎病的效果[8]。馮玉龍等利用拮抗芽孢桿菌發(fā)酵液的硫酸銨沉淀物來防治草莓黃萎病[9]。徐淑華等利用2株拮抗細菌和多種植物提取物防治草莓黃萎病，并取得初步成效[10]。甄文超等利用藥用植物源土壤添加物控制草莓再植病害，針對草莓再植病害的3種主要病原菌：Rhizoctonia solani、Fusarium oxysporum和Verticillium dahliae篩選了125種藥用植物腐解物提取液具有抑菌活性，并證明川芎和苦參的等量混合物有望用于草莓黃萎病害的防治[11]。趙秀娟等從草莓根圍分離的拮抗細菌發(fā)酵液對草莓重茬病害有一定防效[12]。宋志偉等用1種復合微生物制劑對草莓黃萎病的田間防效達76.9%～846%[13]。Vosatka 等用AMF （Arbuscular micorrhizal fungi） 和Pseudomonas putida同時接種草莓根際土壤發(fā)現(xiàn)，它們具有增效互作作用[14]；利用Agrobacterium radiobacter能夠促進AMF 在草莓根際定殖[15]。Porras等利用太陽能土壤消毒和木霉菌劑結(jié)合的方法，明確了在太陽高溫消毒后再添加生物菌劑的方法，2年防效達84.5%[16]。但在當前的草莓生產(chǎn)中，防治草莓枯萎病等土傳病害，仍缺乏高效穩(wěn)定的生防制劑。

本研究采用菌絲生長速率法測定了草莓枯萎病菌對寡雄腐霉、嘧啶核苷類抗菌素、春雷霉素，井岡霉素、超敏蛋白、乙蒜素、申嗪霉素、氨基寡糖素8種生物殺菌劑的室內(nèi)毒力。結(jié)果表明，8種生物殺菌劑的毒力大小順序為申嗪霉素>寡雄腐霉>超敏蛋白>嘧啶核苷類抗菌素>乙蒜素>氨基寡糖素>井岡霉素>春雷霉素。申嗪霉素為我國自主開發(fā)的抗生素類生物殺菌劑，是由熒光假單胞菌菌株M18經(jīng)發(fā)酵、提取而成，對西瓜枯萎病、辣椒疫病等土傳病害有良好的防治效果[17]，本研究中申嗪霉素對草莓枯萎病菌菌絲生長的抑制活性最強，表明該藥劑具有較好的應用前景。本研究僅進行了殺菌劑的室內(nèi)篩選，還有待于在田間開展藥劑防治試驗，同時還需進一步研究各類藥劑的應用技術(shù)，確保草莓的綠色無公害生產(chǎn)。

參考文獻：

[1]賈冬梅. 大棚草莓的主要病害及防治[J]. 河北果樹，2000（1）：38.

[2]邱強，胡淼，王志田. 原色西瓜甜瓜草莓病蟲與營養(yǎng)診斷圖譜[M]. 北京：中國科學技術(shù)出版社，1996：89-90.

[3]Mass J L. Compendium of strawberry disease[M]. Minnesota：American Phytopathological Society，1998.

[4]趙斌，何紹江. 微生物學實驗[M]. 北京：科學出版社，2002：251.

[5]宗兆鋒，康振生. 植物病理學原理[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2002：244-245.

[6]Schwinn F. Recommended methods for the detection and measurement of resistance of plant pathogens to fungicides：method for fungicide resistance in Tate blight of potato[J]. Plant Protection Bulletin，1982，30：69-71.

[7]王占武，李曉芝，葛建國，等. 拮抗菌B501在草莓根際的定殖及對其他根際微生物的影響[J]. 河北農(nóng)業(yè)科學，2002，6（3）：14-18.

[8]馬寶紅，甄文超，曹克強，等. VAM真菌對草莓促生、防草莓黃萎病效應初探[J]. 河北農(nóng)業(yè)大學學報，2004，27（4）：71-73.

[9]馮玉龍，陽麗，王銀定，等. 草莓病害生物防治初探[J]. 河北農(nóng)業(yè)大學學報，1999，22（3）：59-61.

[10]徐淑華，蔣繼志，姚克文，等. 兩株拮抗細菌對草莓根腐病菌的抑制作用[J]. 河北農(nóng)業(yè)大學學報，2005，28（3）：81-83，97.

[11]甄文超，曹克強，代麗，等. 利用藥用植物源土壤添加物控制草莓再植病害的研究[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學，2005，38（4）：730-735.

[12]趙秀娟，徐文橋，張鳳巧，等. 土壤拮抗微生物對幾種草莓病原菌的拮抗作用測試[J]. 中國農(nóng)業(yè)科技導報，2007，9（2）：77-81.

[13]宋志偉，陳世昌，王小琳，等. 復合微生物制劑對重茬草莓生長及產(chǎn)量品質(zhì)的影響研究[J]. 土壤通報，2006，37（3）：560-562.

[14]Vosatka M，Gryndler M，Prikryl Z. Effect of the rhizosphere bacterium Pseudomonas putida，arbuscular mycorrhizal fungi and substrate composition on the growth of strawberry[J]. Agronomie，1992，12（10）：859-863.

[15]Vosatka M，Gryndler，Jansa J，et al. Post vitro mycorrhization and bacterization of micropropagated strawberry，potato and azalea[J]. Acta Hort，2000，530：313-324.

[16]Porras M，Barrau C，Romero F. Effects of soil solarization and Trichoderma on strawberry production[J]. Crop Protection，2007，26（5）：782-787.

[17]新農(nóng)藥介紹[J]. 農(nóng)藥科學與管理，2007，28（5）：60.張斌，梁雪杰，喬俊卿，等. 29種常用殺菌劑對番茄枯萎病菌和青枯病菌的室內(nèi)毒力測定[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2014，42（9）：106-109.

[7]王占武，李曉芝，葛建國，等. 拮抗菌B501在草莓根際的定殖及對其他根際微生物的影響[J]. 河北農(nóng)業(yè)科學，2002，6（3）：14-18.

[8]馬寶紅，甄文超，曹克強，等. VAM真菌對草莓促生、防草莓黃萎病效應初探[J]. 河北農(nóng)業(yè)大學學報，2004，27（4）：71-73.

[9]馮玉龍，陽麗，王銀定，等. 草莓病害生物防治初探[J]. 河北農(nóng)業(yè)大學學報，1999，22（3）：59-61.

[10]徐淑華，蔣繼志，姚克文，等. 兩株拮抗細菌對草莓根腐病菌的抑制作用[J]. 河北農(nóng)業(yè)大學學報，2005，28（3）：81-83，97.

[11]甄文超，曹克強，代麗，等. 利用藥用植物源土壤添加物控制草莓再植病害的研究[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學，2005，38（4）：730-735.

[12]趙秀娟，徐文橋，張鳳巧，等. 土壤拮抗微生物對幾種草莓病原菌的拮抗作用測試[J]. 中國農(nóng)業(yè)科技導報，2007，9（2）：77-81.

[13]宋志偉，陳世昌，王小琳，等. 復合微生物制劑對重茬草莓生長及產(chǎn)量品質(zhì)的影響研究[J]. 土壤通報，2006，37（3）：560-562.

[14]Vosatka M，Gryndler M，Prikryl Z. Effect of the rhizosphere bacterium Pseudomonas putida，arbuscular mycorrhizal fungi and substrate composition on the growth of strawberry[J]. Agronomie，1992，12（10）：859-863.

[15]Vosatka M，Gryndler，Jansa J，et al. Post vitro mycorrhization and bacterization of micropropagated strawberry，potato and azalea[J]. Acta Hort，2000，530：313-324.

[16]Porras M，Barrau C，Romero F. Effects of soil solarization and Trichoderma on strawberry production[J]. Crop Protection，2007，26（5）：782-787.

[17]新農(nóng)藥介紹[J]. 農(nóng)藥科學與管理，2007，28（5）：60.張斌，梁雪杰，喬俊卿，等. 29種常用殺菌劑對番茄枯萎病菌和青枯病菌的室內(nèi)毒力測定[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2014，42（9）：106-109.

[7]王占武，李曉芝，葛建國，等. 拮抗菌B501在草莓根際的定殖及對其他根際微生物的影響[J]. 河北農(nóng)業(yè)科學，2002，6（3）：14-18.

[8]馬寶紅，甄文超，曹克強，等. VAM真菌對草莓促生、防草莓黃萎病效應初探[J]. 河北農(nóng)業(yè)大學學報，2004，27（4）：71-73.

[9]馮玉龍，陽麗，王銀定，等. 草莓病害生物防治初探[J]. 河北農(nóng)業(yè)大學學報，1999，22（3）：59-61.

[10]徐淑華，蔣繼志，姚克文，等. 兩株拮抗細菌對草莓根腐病菌的抑制作用[J]. 河北農(nóng)業(yè)大學學報，2005，28（3）：81-83，97.

[11]甄文超，曹克強，代麗，等. 利用藥用植物源土壤添加物控制草莓再植病害的研究[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學，2005，38（4）：730-735.

[12]趙秀娟，徐文橋，張鳳巧，等. 土壤拮抗微生物對幾種草莓病原菌的拮抗作用測試[J]. 中國農(nóng)業(yè)科技導報，2007，9（2）：77-81.

[13]宋志偉，陳世昌，王小琳，等. 復合微生物制劑對重茬草莓生長及產(chǎn)量品質(zhì)的影響研究[J]. 土壤通報，2006，37（3）：560-562.

[14]Vosatka M，Gryndler M，Prikryl Z. Effect of the rhizosphere bacterium Pseudomonas putida，arbuscular mycorrhizal fungi and substrate composition on the growth of strawberry[J]. Agronomie，1992，12（10）：859-863.

[15]Vosatka M，Gryndler，Jansa J，et al. Post vitro mycorrhization and bacterization of micropropagated strawberry，potato and azalea[J]. Acta Hort，2000，530：313-324.

[16]Porras M，Barrau C，Romero F. Effects of soil solarization and Trichoderma on strawberry production[J]. Crop Protection，2007，26（5）：782-787.

[17]新農(nóng)藥介紹[J]. 農(nóng)藥科學與管理，2007，28（5）：60.張斌，梁雪杰，喬俊卿，等. 29種常用殺菌劑對番茄枯萎病菌和青枯病菌的室內(nèi)毒力測定[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2014，42（9）：106-109.