劉曉強 ，袁淋文 ，臧 敏 ，曹 云 ，王 丹 ，楊 勁 *，孔 毅 *

1中國藥科大學生命科學與技術學院，南京 210009；2中國藥科大學藥學院，南京210009

肝臟是機體最重要的藥物代謝器官之一，細胞色素P450酶系（CYP450）是藥物在肝臟內氧化代謝最主要和最重要的酶，是臨床前藥物代謝研究的重要 對 象 。 其 中 CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1和CYP3A4是其中最主要的6種亞型，其含量約占肝臟內CYP450酶總量的80%以上，且90%以上的上市藥物由這6種亞型代謝的，在已經發(fā)現的藥物相互作用中，CY P450酶系引起的藥物相互作用約占全部相互作用的70%。肝微粒體孵育試驗可以在亞細胞水平上確定藥物代謝穩(wěn)定性、藥物對細胞色素酶各亞型的調控等重要特性[1]。在新藥研發(fā)過程中常通過評估新藥對CY P450酶特異性探針底物在體外孵育體系（如人肝微粒體和大鼠肝微粒體的CY P450酶）中代謝的影響程度，判斷該藥物對CY P450酶的抑制作用[2]，從而預測它在體內可能引起的藥物相互作用，為進一步的臨床藥物相互作用試驗提供有價值的信息。

HPPH屬于我國藥品注冊管理辦法化學藥品注冊分類1.1類新藥，尚未在國內外上市銷售，為第二代抗腫瘤光敏劑，分子式為C39H48N4O4，相對分子量為636.37，屬于結構單一、長激發(fā)波長、暗毒性[3-5]小的二氫卟酚類，具體結構見圖1。HPPH具有很好的光動力活性，理想的作用光譜以及很好的靶向性，對腫瘤組織的穿透率高，臨床用于肺癌、食管癌、頭面頸癌、膀胱癌、胃癌等多種實體腫瘤的治療；較第一代相比，其光毒性明顯降低，基本不需要避光，用量小，使用方便，是一種極富市場潛力的光動力療法[6-8]、治療癌癥用的光敏劑。

圖1 HPPH結構

Cocktail探針底物法是指同時給予多種相對低劑量的探針藥物，測定生物樣本中每個探針藥物的代謝率或其他代謝分型指標，以獲取多個代謝酶的表型信息。本實驗采用體外cocktail法研究注射用HPPH對細胞色素P450酶的6種主要亞型 （包括CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4）是否存在抑制作用，為是否進行臨床人體內藥物相互作用研究提供線索。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

注射用HPPH（浙江海正藥業(yè)股份有限公司提供）；α-萘黃酮、非那西汀、奎寧丁、甲苯磺丁脲、磺胺苯吡唑、4-甲基吡唑、酮康唑、氯唑沙宗、（S）-美芬妥因、鹽酸噻氯匹定、O-去甲基右美沙芬酒石酸鹽、6-羥基氯唑沙宗、羥基甲苯磺丁脲均購于百靈威科技有限公司；1-羥基咪達唑侖、4-羥基美芬妥因、對乙酰氨基酚、右美沙芬均購于瑞德肝臟疾病研究（上海）有限公司；馬來酸咪達唑侖購于中國藥品生物制品檢定所；甲醇（色譜純，Merck Co.Ltd.）；乙酸乙酯（色譜純，Roe Scientific INC）；其余試劑均為市售分析純；水為自制超純水。

1.2 儀器

API3000液相串聯質譜聯用儀，含：自動進樣器、在線脫氣系統(tǒng)、柱溫箱、二元梯度泵、電噴霧離子化接口、三重四極桿質譜檢測器、色譜工作站（Analyst 1.4.2）；BT25X型分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；3K15高速冷凍離心機（Sigma公司，美國）；優(yōu)普超純水制造系統(tǒng)；H-101型多功能漩渦混合器（上海醫(yī)科大學儀器廠）；單道移液器（Thermo Electron 公司，美國）。

1.3 動物

Sprague Dawley（SD）大鼠 12 只，6～8 月齡，SPF級，雄性，體重200～230 g，由上海西普爾-必凱試驗動物有限公司中心提供，許可證號SCXK（滬）2008-0016。

1.4 肝微粒體來源[10]

按文獻[10]的方法制備大鼠肝微粒體，用考馬斯亮藍染料結合比色法測定所制備的大鼠肝微粒體的蛋白含量；混合人肝微粒體由瑞德肝臟疾病研究（上海）有限公司提供。

2 方 法

2.1 色譜條件

色譜柱 Phenomenex C18柱（150 mm×2.00 mm，4 micron.）；流動相：1‰甲酸水溶液-甲醇；柱溫：35℃；進樣量：5 μL；內標：格列吡嗪。

2.2 質譜條件

見表1。

表1 質譜條件

3 孵育實驗

3.1 酶活性指標

各亞酶所選擇的探針底物、其代謝產物（見表2）以及特異性抑制劑（見表3）[11-15]，以各底物代謝產物生成量的多寡來評價對應酶的活性。

表2 各亞酶的探針底物、其代謝產物及探針底物終濃度

表3 各亞型抑制劑的選擇以及抑制劑的終濃度

3.2 微粒體體外孵育體系

每個孵育體系總體積200 μL，反應體系中包含NADPH（1 mmol·L-1）、微粒體蛋白（0.5 mg·mL-1）、PBS緩沖液（pH 7.4）、底物、HPPH及各種已確認的抑制劑，反應體系中甲醇終體積分數小于1%。反應在37℃水浴中進行，預孵5 min，加入NADPH啟動反應，30 min后，加冰乙酸乙酯1 mL終止反應。

3.3 實驗設計

本實驗采用cocktail法和單一溫孵結合的方法進行實驗，各分為9組，共18組，每組平行制備3份。其中9組以混合底物[非那西?。–YP1A2）、甲苯磺丁脲（CYP2C9）、S-美芬妥因（CYP2C19）、右美沙芬 （CYP2D6）、 氯唑沙宗 （CYP2E1）、 咪達唑侖（CYP3A4）]進行實驗；9組單獨以CYP3A4酶的特異性底物睪酮進行實驗。各自分別設為純陰性對照組A（不含NADPH）、陰性對照組B、低濃度陽性對照組C、高濃度陽性對照組D、低濃度HPPH實驗組E、次低濃度HPPH實驗組F、中濃度HPPH實驗組G、次高濃度HPPH實驗組H、以及高濃度HPPH實驗組I。分組方案見表4。

表4 溫孵實驗分組方案

根據初步的藥效學和安全性試驗結果設計給藥劑量，以大鼠中劑量組血藥濃度范圍來設計大鼠肝微粒體HPPH濃度，鼠微粒體溫孵實驗HPPH濃度 從 低 到 高 依 次 為 1.00、5.00、10.00、25.00、50.00 μmol·L-1。HPPH濃度一次為以比格犬中劑量組血藥濃度范圍來設計人鼠肝微粒體HPPH濃度，人微粒體溫孵實驗中HPPH濃度從低到高依次為0.50、1.00、2.00、5.00、10.00 μmol·L-1。

3.4 微粒體溫孵樣品處理方法

溫孵結束后，加入置于-18℃冰箱冷藏的乙酸乙酯 1000 μL，內標 10 μL，渦旋混勻 3 min，15000 r·min-1離心5 min，取上清液至干凈玻璃離心管中，置于氮吹儀下40℃吹干，取200 μL流動相復溶，渦旋混勻 1 min，吸取上清液 50 μL 至進樣瓶中，5 μL 進樣。

4 結果與數據統(tǒng)計

4.1 大鼠肝微粒體孵育實驗結果

經大鼠肝微粒體孵育后，各底物的代謝產物生成量變化情況見表5。

表5 大鼠肝微粒體孵育后代謝產物生成量細表（n=3）

在特異性抑制劑的作用下各亞酶底物代謝物生成量均明顯減少，表明上述亞酶活性良好。用SPSS 11.5（IBM SPSS）單因素方差分析得出，上述5種CYP450酶在特異性抑制劑的作用下，其探針底物代謝產物生成量均未明顯減少（P＞0.05），差異不具有統(tǒng)計學意義。因而當HPPH濃度為1.00～50.00 μmol·L-1時 ， 大 鼠 CYP1A2、CYP2C9、CYP2D6、CYP2E1和CYP3A4的各探針底物代謝產物生成量與對照組對比差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。從上述結果看出，在本實驗條件下未發(fā)現注射用HPPH對 大 鼠 的 CYP1A2、CYP2C9、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4產生抑制作用。

4.2 混合人肝微粒體孵育實驗結果

經混合人肝微粒體孵育后，各底物的代謝產物生成量變化情況見表6。

用SPSS 11.5（IBM SPSS）進行單因素方差分析得出，HPPH 在 0.50～10.00 μmol·L-1時，人 CYP1A2的探針藥物代謝產物生成量與對照組對比差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；因而在本實驗條件下，未發(fā)現HPPH對人CYP1A2存在抑制作用。人CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1 各探針藥物代謝產物生成量與對照組對比差異有統(tǒng)計學意義 （P＜0.05）；說明在本實驗條件下HPPH對人CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1 存在抑制作用； 利用SPSS 11.5軟件求得HPPH對人CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1 的 IC50值分別為：5.28 μmol·L-1、10.00 μmol·L-1、2.28 μmol·L-1、5.64 μmol·L-1。 而 HPPH 在 0.50～10.00 μmol·L-1時 ， 對 人CYP3A4，底物咪達唑侖代謝產物生成量與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），對底物咪達唑侖存在抑制作用，經SPSS 11.5軟件分析得IC50值為5.17 μmol·L-1；底物睪酮代謝產物生成量與對照組對比差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），因而在本實驗條件下未發(fā)現HPPH對底物睪酮產生抑制作用。

表6 混合人肝微粒體孵育后代謝產物生成量變化情況（n=3）

5 討 論

經驗證，建立的方法為：對乙酰氨基酚、羥基甲苯磺丁脲、O-去甲基右美沙芬、1-羥基咪達唑侖的正離子LC-MS/MS檢測方法；4-羥基美芬妥因、6-羥基氯唑沙宗的負離子LC-MS/MS檢測方法以及6β-羥基睪酮的LC-MS/MS測定方法。肝微粒體溫孵液中的雜質不干擾樣品的測定，對乙酰氨基酚、羥基甲苯磺丁脲、4-羥基美芬妥因、6-羥基氯唑沙宗以及的6β-羥基睪酮標準曲線線性范圍為10～1000 ng·mL-1，O-去甲基右美沙芬、1-羥基咪達唑侖的標準曲線線性范圍為5～500 ng·mL-1，且線性關系良好；高、中、低3種濃度的批內、批間精密度RSD均小于15%；準確度均在85%～115%；樣品的提取回收率為80%左右，樣品無明顯介質效應，符合生物樣品分析要求。

本實驗中采用的大鼠肝微粒體為普通大鼠肝微粒體，其體內CYP2C19表達很弱，故而未鑒定其探針底物的代謝產物。由于儀器響應、溫孵操作等原因導致某些物質響應可能不穩(wěn)定，因而致使某些數據異常，但是總體趨勢是對的，在本實驗條件下未發(fā)現抑制作用的酶其底物代謝產物的生成量呈平緩趨勢，在本實驗條件下發(fā)現抑制作用的酶其底物代謝產物的生成量呈下降趨勢。大鼠肝微粒溫孵結果與混合人肝微粒體溫孵結果的差異提示HPPH對CYP450的抑制作用可能存在種屬差異。

根據大鼠藥代、大鼠組織分布以及比格犬藥代結果，且假設大鼠與人的血漿組織抽提比相同，人體肝組織的最高濃度僅為0.3 μmol·L-1左右，遠遠低于上述計算得到的IC50值。同時注射用HPPH采用的單次給藥的方式，因而其在機體內不會產生蓄積作用。結合上述兩點，推測HPPH在人體內對所研究的各CYP450亞型不存在抑制作用或者僅存在較弱的抑制作用。

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