路懷志，杜大勇，李雪杰，薛 峰，楊升華，李運田，*

(1南方醫(yī)科大學第二臨床醫(yī)學院，廣州 510515;2解放軍第305醫(yī)院心臟中心;*通訊作者，E-mail:lyt305@126.com)

動脈粥樣硬化是炎癥驅(qū)動的血管病理變化被越來越深刻地認識，在眾多的內(nèi)皮損傷及炎癥誘導因子中，過度的氧化應激產(chǎn)物最近被認為是整個炎癥瀑布效應中的上游因子之一。親環(huán)素A作為氧化應急介導的主要產(chǎn)物，在動脈粥樣硬化斑塊單核/巨噬細胞的炎癥激活中起著至關重要的作用［1，2］，Kim等［3］研究顯示CD147與親環(huán)素A在病變血管壁分布區(qū)域相同，多項研究亦表明親環(huán)素 A在誘導MMPs產(chǎn)生及白細胞遷移中有重要作用，在這些過程中親環(huán)素A與CD147可能存在相互作用。本研究擬通過封閉CD147觀察其對親環(huán)素趨化及誘導MMP-9生成功能的影響，更好地理解二者之間的關系，尋求動脈粥樣硬化治療新靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

CD147shRNA慢病毒載體(BSG－836，上海吉瑪基因有限公司);兔單核細胞分離液(天津灝洋);RPMI1640培養(yǎng)基(Hyclone，美國);小牛血清(PAA，奧地利);胰蛋白酶(Hyclone，美國);佛波脂PMA(Sigma，美國);Trizol(Invitrogen，美國);MMP-9酶聯(lián)免疫試劑盒(R＆D，美國);CD147酶聯(lián)免疫試劑盒(R＆D，美國);親環(huán)素 A(Sigma，美國);Transwell(Costar，美國)儀器:熒光顯微鏡(Olympus，日本);ABI9600PCR儀/ABI7900HT定量PCR儀(ABI，美國)。

1.2 誘導外周血單核細胞到巨噬細胞

選用新西蘭白兔1只，月齡3個月(北京科宇動物養(yǎng)殖中心提供［合格證號:SCXK京)2007－0003］)，采集兔動脈肝素抗凝血，淋巴細胞分離液密度梯度離心及貼壁培養(yǎng)分離單核細胞，于10%胎牛血清的RPMI1640完全細胞培養(yǎng)液(RPMI1640中含2 mmol/L L－谷氨酰胺，100 U/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素)37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，調(diào)整細胞密度為1×106/ml。待上述細胞靜止12 h后，換入含100 nmol/L PMA的RPMI 1640完全培養(yǎng)基，刺激48 h誘導單核細胞轉(zhuǎn)化為巨噬細胞［4－6］。

1.3 CD147 shRNA慢病毒載體侵染單核/巨噬細胞及CD147檢測

將分離并經(jīng)PMA誘導后的細胞繼續(xù)在25 cm2的培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)，加入4 ml完全培養(yǎng)基，37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細胞融合度控制在60%－70%。按照預實驗中所確定的最佳感染方法和感染復數(shù)(multiplicity of infection，MOI)，即聚凝胺 Polybrene5μg/ml，MOI為100。實驗分3組，①空白對照組:僅加入 Polybrene 2μl，不做任何處理;②NC對照組:加入空白慢病毒載體0.1 ml+Polybrene 2 μl;③慢病毒干擾組加入CD147 shRNA慢病毒載體0.1 ml+Polybrene 2 μl。每組設3個重復，把細胞放回培養(yǎng)箱孵育72 h。為明確轉(zhuǎn)染水平，我們采取綠色熒光蛋白(green fluorescent protein;GFP)標記慢病毒載體，對空白對照組與慢病毒轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染72 h后熒光共聚焦顯微鏡下顯像。采用流式細胞儀檢測各組細胞膜表面CD147表達水平，RT-PCR檢測CD147 mRNA水平，ELISA檢測上清液中游離CD147水平。

1.4 親環(huán)素A趨化實驗

采用48孔Transwell室進行趨化實驗，濾膜采用5μm孔徑的PVPF聚碳酸膜。分別以0.5%BSA的RPMI1640趨化液重懸空白對照組、NC對照組、CD147慢病毒組的巨噬細胞，以5×104細胞/孔注入上室，下室加入0.5%BSA的RPMI1640趨化液+200 ng/ml親環(huán)素A，置于37℃5%CO2孵箱中孵化50 min，取出濾膜去除非細胞面細胞后置入甲醇3 min固定，采用Gimsa染色液染色30 min后自來水沖洗后置于高倍鏡下，每孔隨機選取5個視野，累積細胞數(shù)，算出3個復孔的平均值，作為遷移細胞數(shù)。

1.5 干擾CD147-CyPA相互作用對MMP-9表達的影響

按1.2所述細胞分為空白對照組、NC對照組、CD147慢病毒組，每組均設3個重復，分別加入CyPA 200 ng，刺激24 h后吸取上清液，利用ELISA檢測各組MMP-9表達水平。

1.6 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染效果

帶有GFP標記的陰性對照組及慢病毒干擾組均發(fā)出綠色熒光(圖1，見第79頁)，而空白對照組未見綠色熒光。免疫熒光顯示轉(zhuǎn)染率85%左右，說明慢病毒轉(zhuǎn)染成功。

2.2 CD147基因沉默對CD147表達的抑制作用

流式結(jié)果顯示，CD147 shRNA慢病毒可以顯著抑制單核/巨噬細胞 CD147膜分子的表達(P＜0.05)。RT-PCR檢測各組CD147 mRNA表達結(jié)果顯示，各組均可檢測到CD147 mRNA表達，組間存在統(tǒng)計學差異(F=51.420，P=0.000);空白對照組和NC對照組CD147 mRNA表達水平無差異(P=0.796);CD147慢病毒組mRNA表達水平與空白對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000)。ELISA檢測各組CD147蛋白表達結(jié)果顯示，各組均可檢測到CD147蛋白，組間存在統(tǒng)計學差異(F=18.423，P=0.000);空白對照組和NC對照組CD147蛋白表達無顯著差異(P=0.640);CD147慢病毒組與空白對照組相比CD147蛋白表達量存在統(tǒng)計學差異(P=0.000)。

2.3 細胞趨化實驗結(jié)果

細胞趨化實驗結(jié)果顯示，在CyPA刺激下CD147慢病毒組遷移細胞數(shù)目較NC對照組及空白對照組均明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而空白對照組和NC對照組遷移細胞數(shù)差異無統(tǒng)計學意義(P=0.883，見圖2)。

表1 三組間單核/巨噬細胞膜CD147平均熒光強度(MFI)、CD147 mRNA及蛋白表達比較(±s)Table 1 Mean fluorescence intensity(MFI)of membrane CD147，expression of CD147 mRNA and protein in monocytes/macrophages in three groups(±s)

表1 三組間單核/巨噬細胞膜CD147平均熒光強度(MFI)、CD147 mRNA及蛋白表達比較(±s)Table 1 Mean fluorescence intensity(MFI)of membrane CD147，expression of CD147 mRNA and protein in monocytes/macrophages in three groups(±s)

與空白對照組及NC對照組比較，*P＜0.01

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圖1 熒光顯微鏡觀察CD147-shRNA慢病毒干擾組轉(zhuǎn)染效果 (×200)Figure 1 The transfection results of CD147-shRNA lentivirus under fluorescence microscopy (×200)

圖2 在CyPA刺激下三組遷移細胞數(shù)變化Figure 2 Changes of migrated cells in three groups after treated with CyPA

2.4 各組MMP-9蛋白表達

空白組和NC對照組MMP-9蛋白表達量無統(tǒng)計學差異(P=0.632);CD147慢病毒組MMP-9蛋白表達與空白對照組及NC對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P 分別為0.014，0.003，見表2)。

表2 三組間單核巨噬細胞上清液MMP-9蛋白表達比較(±s)Table 2 Expression of MMP-9 in cell supernatant of monocyte/macrophage in three groups(±s)

表2 三組間單核巨噬細胞上清液MMP-9蛋白表達比較(±s)Table 2 Expression of MMP-9 in cell supernatant of monocyte/macrophage in three groups(±s)

方差不齊，采用Brown-Forsythe法檢驗，F(xiàn)為對自由度進行校正后的結(jié)果，樣本均數(shù)間的多重比較采用Dunnett’s T3檢驗;與空白對照組和NC對照組比較，#P＜0.05

CD147慢病毒組 2.00±0.17#

3 討論

CyPA是一種氧化應激誘導的分泌因子，對內(nèi)皮細胞/單核細胞/中性粒細胞等有潛在的趨化作用，是一種在免疫相關的心血管疾病中調(diào)控內(nèi)皮細胞功能的旁分泌和自分泌［7］。Seizer等在研究CD34+組細胞分化進展為泡沫細胞中發(fā)現(xiàn)CD147/MT1-MMP/MMP-9表達水平上調(diào)，CyPA釋放到上清液中促進MMP-9分泌，CyPA抑制劑可減少細胞分化過程中MMP-9表達，提示CyPA對MMP-9的表達存在一定的調(diào)控［8］。對人AS斑塊做免疫組織化學分析顯示CD147與CyPA共同存在且分布一致，內(nèi)皮細胞和巨噬細胞表達CD147和CyPA，二者可能存在相互作用誘導巨噬細胞ERK和核因子－κB信號途徑激活導致MMP-9表達水平上升，降解細胞外基質(zhì)，增加AS斑塊不穩(wěn)定性。

本研究利用CD147 shRNA慢病毒載體轉(zhuǎn)染單核/巨噬細胞，通過封閉CD147來觀察二者在MMP-9產(chǎn)生及介導CyPA趨化作用中是否存在相互作用。流式細胞儀顯示shRNA轉(zhuǎn)染后單核/巨噬細胞膜表面CD147表達水平較對照組及NC組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義，shRNA慢病毒載體侵染是一種能有效降低細胞膜CD147表達水平的手段。對于單核/巨噬細胞趨化實驗，空白對照組與CD147慢病毒組趨化細胞數(shù)比較有統(tǒng)計學差異，說明CyPA對單核/巨噬細胞有趨化作用，并且與空白對照組相比，NC對照組趨化細胞數(shù)沒有明顯下降，說明轉(zhuǎn)染空載體不影響CyPA對單核/巨噬細胞趨化能力，這些均表明CyPA的趨化作用部分依賴于其和細胞膜CD147的相互作用，封閉CD147可抑制CyPA的趨化效能，CD147在該趨化過程中承擔重要角色。通過對細胞培養(yǎng)上清液MMP-9的分析我們同樣觀察到通過阻斷CD147，CyPA促進單核/巨噬細胞分泌MMP-9功能減弱，提示 CyPA通過或部分通過CD147調(diào)節(jié)MMP-9的產(chǎn)生。

CyPA作為一種氧化應激誘導分泌因子，刺激血管平滑肌細胞遷移/增殖，增加內(nèi)皮細胞黏附分子的表達，以及促進大量炎性細胞的趨化活性，在心血管疾病的病理生理中有重要作用，同樣MMP-9是細胞外基質(zhì)再吸收、消弱動脈粥樣斑塊纖維帽導致急性破裂的重要成分，與動脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性密切相關。在2008年，Piot對58位急性心肌梗死病人進行了環(huán)孢素A(可抑制親環(huán)素A)研究，發(fā)現(xiàn)靜脈應用環(huán)孢素A確實可有效減少心肌梗死面積［9］。本研究證實了CD147與CyPA的相互作用在單核/巨噬細胞趨化功能及MMP-9產(chǎn)生中的地位，進一步明確了二者在動脈粥樣硬化斑塊變化中可能起到的作用，干擾二者相互作用治療，比如環(huán)孢素的口服治療，可能為動脈粥樣硬化及其他疾病的治療提供新的方向。

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