戴婷婷，周本江，王 紅，張偉琴，郭艷梅

(1山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院病原生物與免疫學(xué)教研室，汾陽032200;2昆明醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)系;3昆明醫(yī)科大學(xué)海源學(xué)院人體寄生蟲學(xué)教研室)

醫(yī)學(xué)寄生蟲學(xué)在我國是醫(yī)藥衛(wèi)生院校學(xué)生必修的一門基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)課程，屬于形態(tài)學(xué)的范疇。實驗教學(xué)是形態(tài)學(xué)科的重要組成部分，實驗課的主要內(nèi)容就是如何把采集到的大體標(biāo)本制作成能夠長期保存和使用的永久性玻片標(biāo)本。對寄生蟲標(biāo)本進行辨識是醫(yī)學(xué)生培養(yǎng)的重要內(nèi)容，它將為寄生蟲病的診斷、寄生蟲病的防治以及寄生蟲學(xué)的科學(xué)研究打下堅實的基礎(chǔ)［1］。故寄生蟲學(xué)實驗標(biāo)本的制作和保存具有重要意義。

寄生于人體的吸蟲成蟲是寄生蟲學(xué)實驗課中必須觀察的重要標(biāo)本。制作的成蟲玻片標(biāo)本要求能夠顯示其自然狀態(tài)下難以觀察到的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征是寄生蟲學(xué)實驗技術(shù)難題。傳統(tǒng)的標(biāo)本固定、染色、脫水、透明和封片目前仍是吸蟲成蟲玻片標(biāo)本的常規(guī)制作方法［2，3］。本實驗在常規(guī)寄生蟲永久性玻片標(biāo)本制作的基礎(chǔ)上，摸索出了并殖吸蟲、華支睪吸蟲成蟲染色標(biāo)本制作的理想條件。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蟲體來源 并殖吸蟲活體成蟲自實驗動物模型家貓的肺臟或胸腔獲得，華支睪吸蟲活體成蟲獲自家貓的肝膽管內(nèi)。

1.1.2 主要試劑及其配制 勞氏(Looss)固定液(氯化汞飽和水溶液100 ml，冰醋酸2－4 ml);鹽酸卡紅染液(卡紅粉 4 g，鹽酸 2 ml，蒸餾水15 ml，85%乙醇95 ml);1%鹽酸乙醇(70%乙醇99 ml，濃鹽酸1 ml);3%碘液、梯度乙醇(35%－100%)、二甲苯、中性樹膠。

1.1.3 主要儀器 生物體視鏡(XTT型實體顯微鏡)、光學(xué)顯微鏡(2XA850883)。

1.2 方法

將取自實驗動物模型的活體成蟲置于37℃無菌生理鹽水中存放5－10 h，使其子宮內(nèi)的部分蟲卵和消化管中的黑色殘留物排出，便于收集蟲卵和減少雜質(zhì)對封片標(biāo)本的影響［4］。小型吸蟲成蟲玻片標(biāo)本的制作步驟如下。

1.2.1 固定 ①壓平:取載玻片和蓋玻片各一張，在載玻片中央滴加清水，將蟲體自盛有生理鹽水的培養(yǎng)皿內(nèi)移至載玻片上，平放在清水中并擺正位置(腹吸盤居中)。將蓋玻片輕輕覆蓋在蟲體表面，用解剖針緩慢輕壓，并不斷調(diào)整蟲體姿態(tài)，待蟲體充分伸展、厚薄適宜、口腹吸盤位置正常、內(nèi)部主要結(jié)構(gòu)顯現(xiàn)為止。②固定:用濾紙片吸干載玻片上多余的水分，從蓋玻片邊緣緩慢滴入2－3滴勞氏液，并根據(jù)需要適時補充固定液，蟲體自外緣向中心逐漸發(fā)白，待整條蟲體完全變白且失去伸縮性后，輕輕移開蓋玻片，將初步固定的蟲體轉(zhuǎn)入凹皿內(nèi)，再滴加少量的勞氏液繼續(xù)固定1－2 h。③終止固定:吸棄勞氏液，用蒸餾水清洗2－3遍。④適應(yīng)等滲:依次用35%、50%、70%的梯度乙醇浸泡各30 min后，再換一次70%的乙醇。⑤脫汞:在70%乙醇浸泡蟲體的凹皿中滴加2－3滴3%的碘液，用滴管吹打均勻，使其成濃茶色即可，留置1－2 d且間歇吹打。⑥脫碘:吸棄碘液，加入70%乙醇洗脫去碘，液體若為茶色，勤換乙醇，輕輕反復(fù)吹打，注意千萬不能傷及蟲體，待蟲體顏色完全變白為止。保存在70%乙醇中以備染色。

1.2.2 染色 ①染色:將壓平固定、脫汞脫碘處理后的蟲體自70%乙醇保存液中移入平皿內(nèi)，加入鹽酸卡紅染液以淹沒蟲體為宜，浸染時間分2，4，6 h 3個組別。②脫色:將染液中的蟲體標(biāo)本移入70%乙醇中沖洗數(shù)次，并用滴管不斷沖洗蟲體直至沒有染液析出為止。③分色:將脫色后的蟲體移入1%鹽酸乙醇中分色，做2，6，10 min的分組試驗。分色過程必須在體視顯微鏡進行，需要密切觀察分色的程度。④沖洗:將分色后的標(biāo)本移入70%乙醇中換洗2次，并用滴管不斷沖洗蟲體。可暫時保存在80%的乙醇中以備制片。

1.2.3 脫水 把蟲體組織內(nèi)水分逐漸脫凈，以便透明和封片。將蟲體依次移至80%，85%，90%，95%和無水乙醇內(nèi)進行梯度脫水，分20，30，40 min三個組別，可隨濃度的升高而適當(dāng)縮短脫水的時間。

1.2.4 透明 將經(jīng)無水乙醇脫水后的蟲體移入二甲苯中透明，分20，25，30 min三個組別。

1.2.5 封片 封片前根據(jù)蟲體大小選擇適宜規(guī)格的蓋玻片。取經(jīng)清潔液處理過的潔凈載玻片，在其中1/3與右1/3交界處滴加中性樹膠(用二甲苯溶解稀釋到適宜的黏稠度)2－3滴，將透明滿意的蟲體從透明液中取出后，迅速從一側(cè)插入樹膠中(盡量縮短與空氣接觸的時間，否則蟲體會因吸水而發(fā)白)，擺正體位使腹面向上、頭端朝下，待樹膠浸過蟲體，然后用小鑷子夾取潔凈的蓋玻片，由左側(cè)徐徐蓋下，即基本完成制片過程。如樹膠中有較大的氣泡，可用解剖針輕輕挑去，然后平放在防塵托盤內(nèi)，保存在通風(fēng)、避光、防震、防潮處或干燥箱內(nèi)干燥，經(jīng)鑒定后在玻片的左1/3處貼上記錄標(biāo)簽，標(biāo)注名稱(學(xué)名和中文名)及蟲齡等重要信息。

圖1 并殖吸蟲成蟲口吸盤和卵黃腺Figure 1 Oral sucker and vitellaria of Paragonimus

圖2 并殖吸蟲成蟲腹吸盤和腸支Figure 2 Ventral sucker and intestinal branches of Paragonimus

圖3 并殖吸蟲黑褐色的子宮內(nèi)充滿蟲卵Figure 3 Uterus of Paragonimus(full of eggs)

圖4 并殖吸蟲一對睪丸Figure 4 A pair of testes of Paragonimus

圖5 華支睪吸蟲成蟲染色標(biāo)本Figure 5 Adult worm stained samples of Clonorchis sinensis

圖6 華支睪吸蟲腹吸盤、子宮內(nèi)充滿蟲卵Figure 6 Ventral sucker and uterus of Clonorchis sinensis

圖7 華支睪吸蟲的卵巢、受精囊、睪丸Figure 7 Ovary，spermatheca and testes of Clonorchissinensis

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)本處理

對染色、分色、脫水和透明時間等步驟分別進行分組試驗處理標(biāo)本，經(jīng)過摸索發(fā)現(xiàn)，染色時間2－4 h為宜，蟲體內(nèi)部器官呈現(xiàn)深紅色。分色時間為6 min時，蟲體內(nèi)各組織器官色差明顯、層次清晰，此時蟲體外表面為淺玫瑰紅色。脫水時間不宜過短，30 min最佳，可將組織內(nèi)的水分脫凈。透明時間30 min為宜，不可過長，待整體完全透明、內(nèi)臟器官清晰可見即可封片。

2.2 結(jié)構(gòu)觀察

本實驗技術(shù)制作的標(biāo)本有以下特征:

2.2.1 標(biāo)本可清晰地看到并殖吸蟲成蟲的口吸盤呈淺紅色，卵黃腺呈現(xiàn)深紅色，腺組織發(fā)達，分布于蟲體的兩側(cè)、背面及腹面的兩外側(cè)，由口吸盤后緣起直至蟲體末端(圖1，見第549頁)。腹吸盤亦為淺紅色和鮮紅色的兩側(cè)腸支。腸支在食道后分為兩支，經(jīng)3－4個波浪狀彎曲伸達蟲體亞末端(圖2，見第549頁)。

2.2.2 標(biāo)本可見并殖吸蟲成蟲的子宮團深紅色，龐大而明顯，子宮管蟠曲成團，內(nèi)含大量黑褐色蟲卵呈顆粒狀，密布于子宮內(nèi)部(圖3，見第550頁)。2個睪丸玫紅色，左右并列于蟲體后1/3處，位于腸支之間。睪丸中心體較小，呈長形分葉狀，分葉長短粗細不一，分3－5葉，分葉末端常有膨大(圖4，見第550頁)。

2.2.3 華支睪吸蟲成蟲蟲體半透明、狹長、扁平，狀似葵花籽，前端較窄，后端鈍圓(圖5，見第550頁)。雌性生殖器官有1個分葉狀的卵巢呈玫紅色，受精囊淡紅色、橢圓形，位于卵巢的斜后方。棕色子宮位于卵巢與淡粉色的腹吸盤之間，其內(nèi)充滿黑褐色蟲卵。雄性生殖器官有1對紫紅色分支狀睪丸，前后排列在蟲體后1/3處。棕黃色的卵黃腺濾泡狀，分布于蟲體中段兩側(cè)(圖6、7，見第550頁)。

3 討論

小型吸蟲，如并殖吸蟲、華支睪吸蟲成蟲的永久性玻片標(biāo)本的制作過程一般包括固定、染色、脫水、透明和封片五個主要步驟，各步驟間環(huán)環(huán)相扣，任何一個環(huán)節(jié)被疏忽都會影響到整個標(biāo)本的制作效果。固定的目的是防止生物標(biāo)本的組織細胞自溶或腐敗，是制作標(biāo)本最基礎(chǔ)的一步。標(biāo)本固定應(yīng)選擇活的成蟲，死亡后固定效果差，并且會影響到后面的染色。本實驗選擇勞氏液固定蟲體，是基于冰乙酸有克服單純固定液容易引起蟲體收縮的作用，勞氏液可凝固蛋白質(zhì)，也可較好地固定胞質(zhì)和胞核，并可使蟲體充分伸展［5］。

染色是標(biāo)本制作的重要環(huán)節(jié)，決定著標(biāo)本的質(zhì)量。最佳效果是經(jīng)過染色后的蟲體不同部位、不同組織間呈現(xiàn)出一定的色差，這樣才有利于觀察寄生蟲的形態(tài)和結(jié)構(gòu)［6］。標(biāo)本染色后必須使用脫水劑將組織內(nèi)的水分脫盡，才有利于組織的透明和玻片標(biāo)本的保存。否則，寄生蟲組織內(nèi)的水分能分解組織、阻止透明劑的滲入和油溶性的封片劑混合。脫水是從低濃度乙醇到高濃度乙醇逐級進行，緩慢地將組織內(nèi)的水分吸出，反之易引起組織強烈的收縮而變形，直接影響到生物標(biāo)本的內(nèi)部結(jié)構(gòu)和形態(tài)，不利于標(biāo)本的觀察和鑒定。但高濃度乙醇很容易使染好的標(biāo)本變脆，故浸泡時間不宜太長。標(biāo)本經(jīng)脫水后體內(nèi)仍可能存在一些雜質(zhì)，會影響到光線的穿透。必須放置在透明劑(二甲苯)中透明，通過改變標(biāo)本的折光率，從而使更多的光線能夠透過組織，便于顯微觀察和封片永久保存。封片是標(biāo)本制作的最后一道工序，需要使用封固劑。封固劑一般使用加拿大樹膠或中性樹膠(neutral balsam)，后者為國產(chǎn)天然樹膠，淺黃色透明液體，一般購置后即可使用。若過于黏稠可加入適量的二甲苯稀釋，過稀時打開瓶蓋放置在37℃烤箱中一定時間即可。中性樹膠不溶于水，干燥后形成無色透明固體，牢固地黏附在蓋玻片與載玻片之間，能夠隔絕被封固的標(biāo)本與外界空氣接觸，避免標(biāo)本受潮、干裂和被氧化而褪色，蟲體不會出現(xiàn)收縮變形等現(xiàn)象，有利于標(biāo)本長期保存。

吸蟲標(biāo)本制作質(zhì)量的好壞亦與工作經(jīng)驗有著很大的關(guān)系。具體到不同蟲種，其實際操作步驟有所不同［7］。標(biāo)本制作方法關(guān)鍵在于:①標(biāo)本固定過程中壓得越平整其細微結(jié)構(gòu)越清晰，但切勿壓破。至于是否加壓固定視蟲體大小厚薄而定，并殖吸蟲和華支睪吸蟲的成蟲個體較小，只需輕壓成形即可。②染色及分色依蟲體大小與厚薄而定，并殖吸蟲成蟲比華支睪吸蟲厚，則染色和分色的時間稍長。分色結(jié)果決定著染色的成敗，分色要恰到好處，顏色不能過深也不能過淺，要在生物體視鏡下密切觀察，一直分到各內(nèi)臟器官色度適宜為止。③脫水必須充分徹底，時間視標(biāo)本的大小厚薄而定。如果水分不能完全脫盡，則不易透明，若在封片時的透明劑內(nèi)出現(xiàn)白色混濁現(xiàn)象，需重復(fù)脫水。蟲體脫水后較硬易碎，最好用小勺移動蟲體，并且一定要輕拿輕放，否則易損壞蟲體結(jié)構(gòu)，令制片過程夭折。④透明時間30 min即可，時間太長標(biāo)本變得很脆，不易封片。⑤封片時中性樹膠的量要恰到好處，過多影響美觀，過少易產(chǎn)生氣泡，且使蟲體與空氣接觸而發(fā)白。操作時，將蓋玻片稍傾斜使其一側(cè)先與樹膠接觸，再緩慢地將其放下，盡量減少或避免氣泡產(chǎn)生。若樹膠液不足以覆滿標(biāo)本，可從蓋玻片邊緣補充，但需要注意避免蟲體移位。一般標(biāo)本與蓋玻片四邊的距離約為2 mm，太靠邊緣標(biāo)本易受空氣中酸的作用而褪色，甚至損壞。

高質(zhì)量的標(biāo)本用于教學(xué)，學(xué)生容易在顯微鏡下觀察到蟲體內(nèi)部的細微結(jié)構(gòu)，能使理論教學(xué)與實驗觀察有機地結(jié)合起來，不僅減輕了帶教老師的工作強度，還能有效地提高實驗教學(xué)課的教學(xué)效果。本實驗標(biāo)本的制作技術(shù)對傳統(tǒng)的制作方法進行了改進，通過對染色、分色、脫水和透明時間等步驟分別進行分組試驗處理，摸索出了小型吸蟲成蟲永久性玻片標(biāo)本制作的最佳條件，是理想的寄生蟲學(xué)教學(xué)標(biāo)本和科研標(biāo)本制作的實驗技術(shù)。運用本方法制作的并殖吸蟲、華支睪吸蟲成蟲玻片標(biāo)本形態(tài)逼真、色澤鮮艷、內(nèi)部結(jié)構(gòu)清晰、組織器官層次分明、長期保持不褪色。不僅能夠延長保存時間，而且能夠顯示出其自然狀態(tài)下的重要形態(tài)結(jié)構(gòu)，如吸盤、消化系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)等結(jié)構(gòu)特征清晰可見，是鑒定寄生蟲蟲種的重要基礎(chǔ)［8，9］。

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