蔡 競(jìng) 吳克明 黃 麗 熊婷婷 廖鳳嬌 陜西中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院婦科（咸陽(yáng)712000）

△成都中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院（成都610075）

卵泡發(fā)育障礙是指卵泡發(fā)育、成熟和排出障礙，主要表現(xiàn)為卵巢功能低下，是臨床上引起月經(jīng)量少、月經(jīng)稀發(fā)、閉經(jīng)、不孕、甚至卵巢功能早衰等疾病的主要原因，其臨床發(fā)病率居高不下，嚴(yán)重影響了婦女的生殖和心理健康。

雷公藤多苷是目前臨床上使用較多的非甾體類免疫抑制劑，其對(duì)女性生殖系統(tǒng)的影響主要表現(xiàn)為月經(jīng)紊亂和閉經(jīng)。因此有許多研究者利用其生殖毒性成功建造了卵巢功能低下的動(dòng)物模型，并利用該動(dòng)物模型大量深入的研究了卵巢功能低下類疾病的病理機(jī)制。

PI3K/AKT信號(hào)通路廣泛存在于細(xì)胞中，是參與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和分化調(diào)節(jié)的信號(hào)通路。近年來(lái)，許多學(xué)者利用基因突變動(dòng)物模型進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)此信號(hào)通路在哺乳動(dòng)物始基卵泡激活、卵泡生長(zhǎng)及其排卵過程中均起著非常重要的作用。雷公藤多苷抑制卵泡發(fā)育是否與該信號(hào)通路有關(guān)，目前尚未見報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)研究擬以PI3K/AKT信號(hào)通路為切入點(diǎn)研究雷公藤多苷抑制卵泡發(fā)育的分子機(jī)制，為臨床防治雷公藤多苷雌性生殖毒性提供客觀依據(jù)。

1 材料與方法1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組處理 雌性成年SD大鼠，清潔級(jí)，7～8周齡，健康，體重200～220g，自由飲水?dāng)z食，室溫控制在22℃～25℃，濕度為70%，連續(xù)5～10d行陰道脫落細(xì)胞涂片，并伊紅染色，光學(xué)顯微鏡下觀察陰道脫落細(xì)胞變化，選出連續(xù)2次情動(dòng)周期為4～5d的大鼠18只納入實(shí)驗(yàn)。將18只大鼠按區(qū)組隨機(jī)法分為模型組和對(duì)照組，每組9只，兩組動(dòng)物體重比較無(wú)顯著性差異。模型組大鼠每日灌服雷公藤多苷40mg/kg，對(duì)照組大鼠灌服等劑量的蒸餾水，灌胃第8周始行陰道脫落細(xì)胞檢查觀察大鼠性周期變化，當(dāng)模型組所有大鼠出現(xiàn)動(dòng)情周期延長(zhǎng)甚至紊亂時(shí)，確定造模成功。稱重、采血后處死大鼠，摘取雙側(cè)卵巢，稱重，一側(cè)卵巢置入液氮罐中保存?zhèn)錂z，另一側(cè)卵巢置入4%多聚甲醛溶液中固定。

1.2 試劑及耗材 雷公藤多苷片由湖南協(xié)力藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；E2、P放免試劑盒購(gòu)于天津九鼎醫(yī)學(xué)生物工程有限公司；FSH、LH ELISA試劑盒由成都天合利科技有限公司提供美國(guó)Rapid BioLab.公司產(chǎn)品；兔抗鼠p－AKT（Ser473）多克隆抗體、兔抗鼠p－mTOR（Ser2448）多克隆抗體、兔抗鼠p－p70S6K（Ser 389）多克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Cell Signailing Technology公司，相應(yīng)的二抗均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 檢測(cè)指標(biāo) 1.3.1 一般情況：包括精神狀態(tài)、進(jìn)食、活動(dòng)情況以及大小二便情況，每周測(cè)量大鼠體重，根據(jù)體重調(diào)整用藥劑量。

1.3.2 動(dòng)情周期：造模后第8周起每日早晨8點(diǎn)行陰道脫落細(xì)胞涂片，固定后行伊紅染色，光學(xué)顯微鏡下觀察陰道脫落細(xì)胞形態(tài)，以確定大鼠動(dòng)情周期變化。

1.3.3 性激素水平：最后一次給藥24h后，股動(dòng)脈取血，常規(guī)分離出血清，采用酶聯(lián)免疫吸附法（euzymelinked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)血FSH和LH水平；采用γ放射免疫分析法（radio immune assay，RIA）測(cè)定血清E2、P的含量。

1.3.4 卵巢指數(shù)：最后一次給藥24h后，股動(dòng)脈取血后處死動(dòng)物，剖腹小心取出完整卵巢（雙側(cè)），去掉筋膜與脂肪組織，電子天平稱重，按以下公式計(jì)算得出卵巢指數(shù)［1］：

卵巢指數(shù)＝卵巢濕重（mg）/體重（g）×100%

1.3.5 卵巢組織形態(tài)學(xué)：取出一側(cè)卵巢，置于4%多聚甲醛溶液中固定，充分固定24h后進(jìn)行脫水，卵巢組織切片，常規(guī)HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.3.6 各級(jí)卵泡計(jì)數(shù)：HE染色的大鼠卵巢組織切片于20倍光學(xué)顯微鏡下觀察，計(jì)數(shù)每張切片上各級(jí)卵泡、閉鎖卵泡的數(shù)目。各級(jí)卵泡的分類參照 Myers［2］等的分類方法：①原始卵泡：包括始基卵泡和初級(jí)卵泡，始基卵泡由一個(gè)中央的卵母細(xì)胞和單層扁平的顆粒細(xì)胞組成，初級(jí)卵泡由中央的卵母細(xì)胞和其周圍單層的立方狀顆粒細(xì)胞組成，或者單層的顆粒細(xì)胞中至少有3個(gè)立方的上皮細(xì)胞。②次級(jí)卵泡（或者稱為竇前卵泡）：卵泡包含2層或者2層以上的顆粒細(xì)胞，沒有形成竇腔。③竇狀卵泡：卵泡中包含2層或者2層以上的顆粒細(xì)胞，有竇腔形成。④閉鎖卵泡：卵泡壁凹陷，卵母細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞核固縮或溶解；顆粒細(xì)胞及卵泡膜細(xì)胞松散、萎縮并脫落進(jìn)入卵泡腔；透明帶塌陷。為避免重復(fù)計(jì)數(shù)，原始卵泡以卵母細(xì)胞核作為標(biāo)記物計(jì)數(shù)；次級(jí)卵泡和竇狀卵泡以卵母細(xì)胞核仁為標(biāo)記物計(jì)數(shù)。

計(jì)算方法：各級(jí)卵泡計(jì)數(shù)：以每個(gè)卵巢切面上不同發(fā)育階段卵泡各占整個(gè)卵巢切面上總卵母細(xì)胞數(shù)的百分比表示各級(jí)卵泡的數(shù)目。

1.3.7 Western－blotting法檢測(cè)卵巢 組織中 p－AKT、pmTOR、p－p70S6K含量：大鼠的另一側(cè)卵巢置入液氮中備檢，常規(guī)方法提取卵巢組織總蛋白，進(jìn)行SDS－PAGE凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用TBST稀釋的5%的脫脂奶粉室溫（18℃）封閉 PVDF膜1h，分別加入相應(yīng)的一抗（p－AKT、pmTOR、p－p70S6K、β－ACTIN，濃度均為 1：1000），4℃ 過夜；TBST洗膜3次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗兔IgG二抗（用含5%脫脂奶粉的PBST 1：2 000稀釋），37℃1h；最后用化學(xué)發(fā)光顯示目的條帶，quantity one分析軟件分析蛋白灰度值，目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量＝目的蛋白灰度值/內(nèi)參灰度值。

2 結(jié) 果2.1 一般情況 在造模最初的1～2周內(nèi)，模型大鼠體重增加不明顯，少數(shù)大鼠體重減輕，2周后大鼠體重逐漸增加，但增加較對(duì)照組緩慢。在造模過程中，模型組大鼠逐漸出現(xiàn)反應(yīng)較遲鈍，精神萎靡，活動(dòng)減少，體毛暗淡無(wú)光澤，大便量多且偏稀，豎毛，蜷縮拱背，畏寒肢冷，喜扎堆等。造模10周后，模型組大鼠體重較對(duì)照組明顯下降（P＜0.01，見表1）。

表1 兩組大鼠體重的比較（±s）

表1 兩組大鼠體重的比較（±s）

注：與對(duì)照組比較：▲▲P＜0.01。

組別 動(dòng)物（只）體重（g）9 255.59±14.24模型組 9 235.22±13.85對(duì)照組▲▲

2.2 動(dòng)情周期變化 大鼠正常的動(dòng)情周期為4～5d，應(yīng)用雷公藤多苷造模10周后，模型組大鼠動(dòng)情周期延長(zhǎng)甚至紊亂，表現(xiàn)為動(dòng)情周期大于7d，持續(xù)的動(dòng)情間期，無(wú)動(dòng)情前期及動(dòng)情期，個(gè)別大鼠表現(xiàn)為持續(xù)的動(dòng)情期。與對(duì)照組相比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，見表2）。

表2 新兩組大鼠動(dòng)情周期的比較（±s）

表2 新兩組大鼠動(dòng)情周期的比較（±s）

注：與對(duì)照組比較：▲▲P＜0.01。

組別 動(dòng)物（只）動(dòng)情周期對(duì)照組9 4.889±0.782模型組 9 8.778±1.394▲▲

2.3 性激素水平變化 見表3。

表3 兩組大鼠性激素水平的比較（±s）

表3 兩組大鼠性激素水平的比較（±s）

注：與對(duì)照組比較：▲▲P＜0.01。

組別 動(dòng)物（只）E2（pg/mL）P（ng/mL）FSH（mIU/mL）LH（mIU/mL）對(duì)照組 9 107.97±27.01 12.88±4.31 1.006±0.074 0.987±0.295模型組 9 19.93±9.46▲▲ 6.01±1.63▲▲1.029±0.082 0.948±0.107

2.4 卵巢濕重及卵巢指數(shù)變化 見表4。

表4 兩組大鼠卵巢濕重和卵巢指數(shù)的比較（±s）

表4 兩組大鼠卵巢濕重和卵巢指數(shù)的比較（±s）

注：與對(duì)照組比較：▲▲P＜0.01。

組別 動(dòng)物（只）卵巢濕重（mg）卵巢指數(shù)（%）9 93.61±16.40 0.365±0.056模型組 9 66.67±6.72▲▲ 0.285±0.037對(duì)照組▲▲

2.5 卵巢組織形態(tài)學(xué)變化 卵巢組織切片HE染色結(jié)果示：對(duì)照組大鼠卵巢可見始基卵泡，各級(jí)卵泡生長(zhǎng)活躍，卵泡體積較大，卵泡液多，顆粒細(xì)胞層較厚，閉鎖卵泡數(shù)目較少，黃體發(fā)育良好，數(shù)目較多。模型組大鼠生長(zhǎng)卵泡數(shù)目減少，卵泡體積減小，顆粒細(xì)胞層較薄，黃體數(shù)目少，閉鎖卵泡數(shù)目多，卵巢體積減小，部分卵巢間質(zhì)增生（見圖1）。

2.5 各級(jí)卵泡計(jì)數(shù)的變化 見表5。

2.6 卵巢組織中p－AKT、p－mTOR、p－p70S6K含量的變化見表6、圖2。

表5 兩組大鼠各級(jí)卵泡百分比的比較（±s）

表5 兩組大鼠各級(jí)卵泡百分比的比較（±s）

注：與對(duì)照組比較：▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

組別 動(dòng)物（只）原始卵泡（%）次級(jí)卵泡（%）竇狀卵泡（%）閉鎖卵泡（%）對(duì)照組 6 34.53±4.08 24.09±3.88 21.50±5.71 19.87±3.14模型組 6 33.92±7.48 16.40±3.44▲▲ 12.64±4.90▲ 37.04±5.83▲▲

表6 兩組大鼠卵巢p－AKT、p－mTOR、p－p70S6K含量的比較（±s）

表6 兩組大鼠卵巢p－AKT、p－mTOR、p－p70S6K含量的比較（±s）

注：與對(duì)照組比較：▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

－P70S6K對(duì)照組 6 1.2436±0.1251 1.1761±0.0956 1.1323±0.072組別 動(dòng)物（只）p－AKT p－mTOR p 6模型組 6 0.7058±0.1511▲▲ 0.7095±0.1867▲▲ 0.6740±0.1192▲▲

圖1 卵巢組織形態(tài)學(xué)變化

圖2 western－blot檢測(cè)卵巢組織中p－AKT、p－mTOR、p－p70S6K的表達(dá)變化

3 討 論卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育是一個(gè)漫長(zhǎng)而復(fù)雜的過程，從胚胎時(shí)期已經(jīng)開始，原始卵泡發(fā)育至成熟卵泡以及排出，依次經(jīng)過始基卵泡、竇前卵泡、竇狀卵泡、排卵前成熟卵泡4個(gè)階段，歷時(shí)長(zhǎng)達(dá)約1年。卵泡由1個(gè)居于核心的卵母細(xì)胞及周圍的顆粒細(xì)胞和卵泡膜細(xì)胞所組成。在卵泡發(fā)育的過程中，顆粒細(xì)胞中FSH和LH受體表達(dá)逐漸增強(qiáng)，受體后的信號(hào)通路功能也逐漸完善，影響顆粒細(xì)胞在促性腺激素調(diào)控下增殖、分化，并促使卵母細(xì)胞不斷成熟［3］。顆粒細(xì)胞可合成多種激素及生長(zhǎng)因子，并表達(dá)其受體，進(jìn)而調(diào)控卵泡的發(fā)育。卵巢顆粒細(xì)胞的增殖、分化、凋亡的機(jī)制及其調(diào)控非常復(fù)雜，涉及到復(fù)雜的分子作用機(jī)制和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

PI3K/AKT信號(hào)通路是一條與細(xì)胞增殖、分化密切相關(guān)的通路，近年來(lái)，許多學(xué)者借助基因突變動(dòng)物模型研究該通路與卵泡發(fā)育的關(guān)系，取得了突破性的進(jìn)展。當(dāng)敲除卵母細(xì)胞中的PTEN基因（PI3K信號(hào)通路的終止信號(hào)），小鼠在成年早期即喪失生育能力，原始卵泡池中的卵泡過早耗竭，F(xiàn)SH、LH水平增高，卵巢體積變小，發(fā)生卵巢早衰［4］。而如果選擇性破壞卵巢顆粒細(xì)胞中的PTEN，則會(huì)減少顆粒細(xì)胞的凋亡，并增加顆粒細(xì)胞的增殖，而且不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞腫瘤的發(fā)生［5］?？梢娫诼涯讣?xì)胞和顆粒細(xì)胞中均存在完整的PI3K/AKT信號(hào)系統(tǒng)，它們共同協(xié)調(diào)，調(diào)節(jié)著卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育、成熟和周期性的排卵。當(dāng)敲除初級(jí)和次級(jí)卵母細(xì)胞中的PTEN，盡管卵母細(xì)胞中的AKT信號(hào)通路被激活，卵泡仍然繼續(xù)生長(zhǎng)發(fā)育至排卵，卵母細(xì)胞的成熟和受孕未受到影響；同樣，敲除卵母細(xì)胞中的初級(jí)和次級(jí)卵母細(xì)胞中的PDK1（PDK1是催化AKT進(jìn)行磷酸化反應(yīng)的必須激酶），亦不影響卵泡的生長(zhǎng)［6，7］。所以在卵母細(xì)胞中，PI3K/AKT信號(hào)通路對(duì)于卵泡的激活具有階段特異性，僅決定著始基卵泡的靜止、存活和激活；而顆粒細(xì)胞中的PI3K/AKT信號(hào)通路則對(duì)于卵泡的進(jìn)一步生長(zhǎng)發(fā)育和周期性的募集以及排卵則是非常重要的。

雷公藤為衛(wèi)矛科植物，最早收載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其根莖為藥用部位，雷公藤多苷（glucoside tripterygium wilfordine，GTW）又稱雷公藤總苷，是其根芯提取物，具有抗炎、抑制免疫、抗生育、抗菌等功效，是目前臨床上使用較多的非甾體類免疫抑制劑，被廣泛用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腎小球腎炎、紅斑性狼瘡及各種自身免疫性疾病和皮膚?。?，9］，其對(duì)女性生殖系統(tǒng)的影響主要表現(xiàn)為月經(jīng)紊亂和閉經(jīng)?；谂R床中對(duì)于女性生殖系統(tǒng)的影響，許多學(xué)者利用動(dòng)物模型，從不同層面研究雷公藤多苷對(duì)模型動(dòng)物生殖系統(tǒng)的損害，已有多項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明［10～18］：雷公藤多苷可使實(shí)驗(yàn)大鼠、小鼠動(dòng)情周期延長(zhǎng)、紊亂甚至消失，體重下降，子宮、卵巢指數(shù)下降，卵巢中各級(jí)生長(zhǎng)卵泡和黃體數(shù)目減少，閉鎖卵泡比例升高；子宮肌層和內(nèi)膜變薄，子宮內(nèi)膜腺體含量減少；血清E2水平下降，F(xiàn)SH、LH水平增高；且隨用藥劑量增加及時(shí)間延長(zhǎng)，損傷程度加重。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與既往實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果相符，這些表現(xiàn)均與人類的卵泡發(fā)育障礙性疾病的表現(xiàn)相類似。

基于PI3K/AKT信號(hào)通路與卵泡發(fā)育的密切關(guān)系以及雷公藤多苷確切的抑制卵泡發(fā)育的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們推測(cè)該信號(hào)通路可能參與了雷公藤多苷抑制卵泡發(fā)育的過程，為了驗(yàn)證這個(gè)的推測(cè)，選擇從蛋白水平檢測(cè)PI3K/AKT信號(hào)通路中的重要信號(hào)分子：AKT、mTOR、p70S6K 的活化形式p－AKT、p－mTOR、p－p70S6K在卵巢中的表達(dá)，以期研究該信號(hào)通路在雷公藤多苷所致卵泡發(fā)育障礙模型中的變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：模型組大鼠卵巢組織中p－AKT、p－mTOR、p－p70S6K 水平均明顯低于對(duì)照組（P＜0.01）。因此我們推測(cè)：PI3K/AKT信號(hào)通路可能參與了雷公藤多苷致模型大鼠卵泡發(fā)育障礙的過程，在該過程中，PI3K/AKT信號(hào)通路中重要的信號(hào)分子的活性均降低，其促增殖、分化的能力下降，因而使卵巢顆粒細(xì)胞正常的增殖過程受到抑制，分泌性激素能力下降，卵泡正常發(fā)育受阻，閉鎖增多。卵泡發(fā)育是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，受多種因素、多個(gè)環(huán)節(jié)的共同調(diào)控，涉及多條信號(hào)通路，如Smads、MAPK等信號(hào)通路，雷公藤多苷是否同時(shí)通過調(diào)控其他信號(hào)通路影響卵泡發(fā)育，還有待于進(jìn)一步研究。

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